基于扩增阻滞突变系统-聚合酶链式反应法的A1/A2牛奶鉴别试剂盒的开发及应用

目的基于扩增阻滞突变系统-聚合酶链式反应(amplification refractory mutation system polymerase chain reaction,ARMS-PCR)技术,开发A1A2牛奶鉴别试剂盒,并对市场上A2牛奶产品进行检测应用,实现对A2牛奶的鉴别检测。方法本研究先利用D-loop基因片段设计了牛内参基因引物探针组(标记FAM荧光)。随后,在β-酪蛋白基因突变位点分别设计了A1基因引物探针组和A2基因引物探针组(均标记VIC荧光)。基于ARMS-PCR技术构建了双通道ARMS-PCR反应体系与程序,进而成功开发了A1A2牛奶实时荧光ARMS-PCR试剂盒。为进一步验证试剂盒性能,将其应用于市场上A2牛奶的检测,并将检测结果与DNA测序法结果对比。结果本试剂盒特异性强,检测DNA灵敏度为0.1 ng/L;10份市售实际样品的应用检测结果与测序结果一致。结论本试剂盒特异性好,灵敏度高、准度度高,适用于A2牛奶的真实性鉴别。

微滴式数字PCR技术检测非小细胞肺癌患者外周血EGFR基因突变

目的分析微滴式数字PCR技术(droplet digital PCR,dd PCR)在非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)患者外周血EGFR基因突变检测中的应用价值。方法采用dd PCR法与扩增阻滞突变系统技术(amplification refractory mutation system,ARMS)分别检测58例NSCLC患者及TKI治疗后耐药患者20例外周血EGFR基因突变,Kappa检验验证dd PCR法检测EGFR基因突变结果与ARMS法的一致性,并对检测结果进行分析比较。结果 ARMS法检测EGFR基因突变共检出34例患者,其中双突变患者5例,dd PCR法共检出38例患者,其中双突变患者10例;两者Kappa值=0.72,阳性一致率为97.50%,阴性一致率为72.73%,总一致率为86.30%;dd PCR法检测接受TKI治疗患者的20外显子p.T790M位点突变检出率为50.00%(10/20),而无TKI用药史患者均未检出;dd PCR法检出突变丰度<1%的突变位点占总突变位点的29.17%(14/48),ARMS法仅检出其中的35.71%(5/14)。结论 dd PCR法与ARMS法相比具有更高敏感性,且可绝对定量,EGFR基因突变的检出率更高。

免疫组化法检测恶性胸腔积液脱落细胞EGFR突变状态

目的:评估免疫组织化学染色法(immunohistochemistry,IHC)在恶性胸腔积液脱落细胞EGFR突变检测中的应用价值。方法:连续纳入我院2012年1月至2013年12月154例肺腺癌患者,筛选合格病例入组,使用扩增阻滞突变系统技术(amplification refractory mutation system,ARMS)和IHC分别检测肺癌组织和胸腔积液脱落细胞的EGFR突变状态。比较两种方法的检测敏感度、特异度和一致率等。结果:85例患者最终纳入本研究,患者平均年龄66.4岁。ARMS法检测肿瘤组织的总体突变率约49.4%,其中E746_A750 del突变率17.6%,L858R突变率22.4%。以ARMS法为金标准,IHC染色检测E746_A750 del和L858R突变的敏感度分别为93.3%和89.5%,两种方法的检测一致性极好。进一步,85例患者胸腔积液的脱落肿瘤细胞检出率为41.2%,IHC法检测E746_A750 del和L858R突变的敏感度分别为83.3%和66.7%,特异度均为100.0%。结论:IHC染色是一种可靠、准确的EGFR突变检测方法,能够获得良好的特异度和一致率,可用于恶性胸腔积液脱落肿瘤细胞的常规筛查。

基于ARMS技术检测不同标本类型BRAF基因状态与甲状腺乳头状癌的相关性探讨

目的:探讨扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system, ARMS)技术检测同一患者不同标本类型BRAF^V600E的突变状态并研究其突变差异性。方法:采用ARMS技术对132例甲状腺细针穿刺细胞学(fine-needle aspiration cytology, FNAC)标本和手术组织学标本进行BRAF^V600E基因突变检测,分析不同标本类型及不同程度病变组织中BRAF^V600E的突变差异性;同时探讨甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)临床病理参数和BRAF^V600E突变的相关性。结果:在细胞学方面,BRAF^V600E基因突变率在FNAC明确诊断PTC中为95.56%,FNAC不能明确PTC中为17.24%;在组织学方面,68例PTC中BRAF^V600E的突变率为85.29%,64例良性组织BRAF^V600E未发现突变。另外,BRAF^V600E突变与PTC临床病理参数,如性别、年龄、肿瘤大小、病灶数目、双侧病灶、是否有腺外侵犯及淋巴结转移等因素均无关(均P>0.05)。结论:基于ARMS法检测BRAF^V600E基因状态是PTC非常重要的鉴别诊断指标,BRAF^V600E与FNAC标本联合运用有效提高了PTC的术前诊断率,具有较高的灵敏度和特异性,但与PTC临床病理参数无关。

非综合征型耳聋患者mtDNA A1555G异质性突变比例与临床表型的关系

目的定量检测非综合征型耳聋患者线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)1555突变型/野生型的拷贝数,探讨突变型/野生型比例与临床表型之间的关系。方法建立实时定量PCR技术和扩增阻滞突变系统(Real-time quantitative PCR和Amplification refractory mutation system,RT-ARMS-qPCR系统)对含突变型和野生型mtDNA 1555位点的拷贝数进行定量检测并计算比例。共检测散发组12例、家系组7例异质性突变患者,结合耳聋患者的临床资料,分析突变型与野生型的比例与耳聋严重程度的关系。结果散发组mtDNA A1555G异质性突变的患者中,突变型mtDNA所占的比例与耳聋轻重程度相关(r=0.771,P=0.003);家系组患者中,突变型mtD-NA所占的比例亦与耳聋轻重程度相关(r=0.850,P=0.015)。结论突变型mtDNA占所有mtDNA的比例与耳聋的严重程度密切相关,是非综合征型耳聋临床表型多样性的分子基础。

K-ras基因突变与结直肠癌临床病理特征的相关性研究

目的:探讨结直肠癌患者K-ras基因突变特点,并分析K-ras基因突变与结肠癌临床病理特征的相关性及其临床意义。方法:收集哈尔滨医科大学附属第一医院收治的500例结直肠癌患者的手术石蜡标本,采用突变扩增阻滞系统技术(amplification refractory mutation system,ARMS)检测K-ras基因第二外显子第12、13密码子的七种热点突变情况,分析其与结肠癌患者临床病理特征的相关性。结果:ARMS法检出K-ras基因突变213例,突变率为42.6%。K-ras基因突变与患者的年龄、性别、肿瘤发生的部位、肿瘤分化程度及有无淋巴结转移均无相关性(P>0.05),而与肿瘤的组织学类型具有相关性(P<0.05)。结论:(1)结直肠癌患者K-ras基因突变率较高,其中GLY12ASP位点突变率最高,GLY12ARG为稀有突变位点。(2)K-ras基因突变与结肠癌的组织学类型相关,可能用于结直肠癌患者治疗方案的选择。