人卵泡壁层颗粒细胞源性非整合诱导多能干细胞的制备

目的探索将卵泡液中壁层颗粒细胞诱导为非整合的诱导多能干细胞(iPS细胞),并检测其颗粒细胞方向的分化能力。方法在取卵的操作过程中,收集废弃的壁层颗粒细胞,在颗粒细胞培养至第4天时,加入iPS仙台病毒,经过20余天的维持,挑取iPS细胞克隆,并扩增培养。对其多能基因表达情况、外源基因整合情况、自然分化能力、颗粒细胞定向分化能力进行鉴定,并与皮肤细胞来源的iPSC系进行平行分化能力比较。结果成功建立了壁层颗粒细胞来源的iPS细胞系,其通过了类似胚胎干细胞的多能性检测及体外三胚层的分化能力检测,尤其在定向分化为颗粒细胞时,分化出了大量FOXL2、CYP19A1和FSHR阳性的细胞,经ELISA试剂盒检测,发现该分化细胞可以分泌AMH并且能够将雄激素转化成雌激素;且颗粒细胞源iPS系较皮肤细胞源的iPS系在颗粒细胞方向的分化效率更高。结论提供了一种从人颗粒细胞建立iPSC的方法,并验证了其颗粒细胞方向分化的优势。该系统不仅可以用于建立生殖不孕疾病的iPSC库,还为颗粒细胞功能障碍不孕的患者提供了一种细胞治疗的新思路。

人卵丘颗粒细胞和壁层颗粒细胞体外培养方法比较

目的:建立有效分离、提纯及培养人卵丘颗粒细胞的方法,并与人壁层颗粒细胞的体外培养相比较。方法:收集卵胞浆内单精子显微注射取卵时的卵泡液和直接机械分离卵母细胞所得的卵丘颗粒细胞复合物,直接将卵丘颗粒细胞复合物接种于培养皿中培养。用密度梯度离心法分离卵泡液中的人壁层颗粒细胞。用免疫荧光法检测卵泡刺激素受体(follicle stimulating hormone receptor,FSHR)的表达;用CCK-8法检测细胞生长曲线;用ELISA检测这2种颗粒细胞分泌雌激素的能力。结果:直接法所得人卵丘颗粒细胞培养24 h后可贴壁,体外培养生长状态与人壁层颗粒细胞相似;免疫荧光检测显示两者均表达FSHR;CCK-8实验结果表明,两者体外培养生长曲线相似;ELISA结果显示两者分泌雌激素能力相当。结论:利用机械切割获得人卵子周围卵丘颗粒细胞复合物直接培养的方法操作简单,获得的人卵丘颗粒细胞具有与人壁层颗粒细胞相似的生长状态、生长曲线以及雌激素分泌能力,可作为人颗粒细胞亚群体外培养方法的补充。

脑源性神经营养因子及其特异性高亲和力受体在颗粒细胞中的表达与多囊卵巢综合征患者卵泡发育的关系

目的探讨多囊卵巢综合征(Polycystic ovary syndrome,PCOS)患者取卵日卵泡壁层颗粒细胞中脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)其高亲和力受体原肌球蛋白受体激酶B(Tyrosine receptor kinase B,Trk B)mRNA在卵泡壁层颗粒细胞的表达,评估BDNF及Trk B与卵母细胞成熟之间的相关性。方法采用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)方法检测56例PCOS患者和44例排卵正常的不孕患者取卵日卵泡壁层颗粒细胞BDNF及Trk B的表达,初步探讨其与卵母细胞成熟的关系及其临床意义。结果①PCOS组BNDF mRNA表达高于对照组(P<0.05),Trk B mRNA表达低于对照组(P<0.05);②PCOS组获卵数显著高于对照组(P<0.05),而卵母细胞成熟率、受精率和优质胚胎率显著低于对照组(P<0.05);③Trk B与BDNF表达强度呈正相关(r=0.502,P<0.05)。结论①BDNF与Trk B可能共同参与了颗粒细胞的生理功能、卵母细胞的成熟以及早期胚胎的发育;②BDNF-Trk B信号通路障碍可能是促使PCOS患者卵巢内卵泡成熟障碍的主要原因。