壳聚糖修饰玻碳电极卷积伏安法测定环境水中的EDTA

制备了壳聚糖修饰玻碳电极 ,研究了Fe(EDTA) -在修饰电极上的吸附还原行为 ,用卷积伏安法通过Fe(EDTA) -的检测测定了环境水中的EDTA。在优化的实验条件下 ,峰电流值与 8.0× 1 0 -7～ 5 .0× 1 0 -6mol L的EDTA呈线性关系 ,回归方程为epp′ =0 .75 2 5c - 0 .661 3,r =0 .991 ,最低检出限为 5 .0× 1 0 -7mol L ,5次测定的相对标准偏差小于 5 .8%。对实际样品测定的回收率为98 1 %～ 1 0 5 % ,对比HPLC的结果 ,相对偏差小于 5 %。

用壳聚糖修饰的MCM-48固定化脂肪酶拆分(R,S)-1-苯乙醇

研究了涂覆壳聚糖(CS)的介孔分子筛MCM-48固定化假单胞菌脂肪酶(PSL),及其在(R,S)-1-苯乙醇转酯化拆分反应中的催化性能.结果表明,壳聚糖与MCM-48的质量比为1∶10时,用有机相固定化法制备的固定化酶PSL/CS-MCM-48显示了较高的催化活性及对映选择性,且高于游离酶和纯壳聚糖固定化酶PSL/CS.在PSL/CS-MCM-48的催化作用下,1-苯乙醇的转化率(C)达到46.9%,(S)-1-苯乙醇的对映体过量值(eeS)达到87.5%,产物(R)-1-乙酸苯乙酯的对映体过量值(eeP)大于99%,对映选择性参数(E)为576.同时,PSL/CS-MCM-48对(R,S)-1-苯乙醇催化转酯化拆分具有良好的重复使用性.

抗坏血酸和尿酸在甘氨酸-壳聚糖修饰玻碳电极上的电化学行为及测定

制备了甘氨酸-壳聚糖复合膜修饰玻碳电极(Gly-CTS/GCE),研究了抗坏血酸(AA)和尿酸(UA)在该修饰电极上的电化学行为。结果表明在pH=5.59的磷酸盐缓冲溶液中,AA、UA在Gly-CTS/GCE上均产生灵敏的不可逆氧化峰,其峰电流与浓度在一定范围内呈良好的线性关系。对AA和UA混合溶液平行测定7次,相对标准偏差分别为4.6%、2.9%,表明该电极重现性和稳定性良好。AA、UA在Gly-CTS/GCE电极上的氧化峰峰电位相差340mV,据此可实现对二者的同时检测,并可应用于实际样品测定。

壳聚糖修饰雷公藤多苷纳米粒的制备及其体外释药研究

目的制备壳聚糖修饰雷公藤多苷纳米粒(LMWC-TG-NPs),并研究其体外释药行为。方法采用改良的自乳化溶剂扩散法制备LMWC-TG-NPs;正交试验设计优化雷公藤多苷纳米粒(TG-NPs)处方,单因素试验考察壳聚糖(LMWC)修饰方式;以含20%乙醇的PBS(pH 7.4)为释放介质考察LMWC-TG-NPs的体外释药行为。结果优化的处方工艺:以1.0%Poloxamer 188、80 mg PLA、12 mL有机相、丙酮-乙醇(2∶3)制备TG-NPs混悬液,以与TG-NPs混悬液等体积的10%LMWC溶液修饰TG-NPs制备LMWC-TG-NPs;根据优化条件制备的LMWC-TG-NPs,外观呈圆形或类圆形,平均粒径为(207.6±3.4)nm,多分散指数(PDI)为0.078±0.009(n=3),包封率和载药量分别为(61.83±2.43)%、(10.70±0.37)%(n=3);体外释药符合Higuchi方程。结论所制备的LMWC-TG-NPs包封率较高,粒径小,体外释药具有明显的缓释特征,为后期研究其肾脏靶向和毒性奠定了基础。

果糖修饰壳聚糖微载体的制备及其原代大鼠肝细胞培养

利用果糖修饰的壳聚糖为材料 ,液体石蜡作分散介质 ,戊二醛作交联剂 ,通过反相悬浮法制备了性能优良的微米级果糖修饰壳聚糖微载体。用其进行原代大鼠肝细胞培养 ,利用相差显微镜和扫描电镜对细胞形态进行观察 ,并测定了细胞的代谢活性。结果显示果糖修饰的壳聚糖微载体是一种优良的肝细胞培养支架。

人肝肿瘤细胞SMMC-7721、HepG2对去甲斑蝥素-半乳糖修饰壳聚糖纳米粒的摄入及S180荷瘤小鼠在体抗肿瘤活性的影响

目的了解人肝肿瘤细胞SMMC-7721、Hep G2对去甲斑蝥素(NCTD)-半乳糖修饰壳聚糖纳米粒(NCTD-GC-NPs)的摄入及S180荷瘤小鼠在体抗肿瘤活性。方法以FITC标记NCTD-GC-NPs为实验组,培养基为空白组,FITC标记去甲斑蝥素壳聚糖纳米粒(NCTD-CS-NPs)为对照组,采用流式细胞仪测定培养1、3、5、9、16、24 h时SMMC-7721、Hep G2细胞对6μg/ml纳米粒的摄入程度及培养5 h时SMMC-7721、Hep G2细胞对1、3、6、12、24μg/ml纳米粒的摄入程度。S180荷瘤小鼠被随机分为8组(n=10),生理盐水组,NCTD组,高、中、低剂量NCTD-CS-NPs组(对照组)、高、中、低剂量NCTD-GC-NPs组(实验组),腹腔注射10 d后剥离肿瘤,计算抑瘤率、胸腺指数、脾指数。结果 SMMC-7721、Hep G2细胞对NCTD-CSNPs、NCTD-GC-NPs的摄入均有时间依赖性,NCTD-GC-NPs的平均荧光强度显著高于NCTD-CS-NPs(P均<0.05)。SMMC-7721、Hep G2细胞对不同浓度NCTD-CS-NPs摄入平均荧光强度显著低于NCTD-GC-NPs(P均<0.05)。SMMC-7721细胞可不同程度地摄入荧光标记后的NCTD-CS-NPs与NCTD-GC-NPs,但对NCTD-GC-NPs的摄入量更大。各给药组的S180荷瘤小鼠的瘤重均低于生理盐水组(P均<0.05);随着NCTD浓度上升,对照组、实验组的抑瘤率也随之提高;各给药组的脾指数与生理盐水组比较均无统计学差异(P均>0.05);低剂量对照组及实验组的胸腺指数高于生理盐水组(P均<0.05),而中、高剂量对照组及实验组的胸腺指数与生理盐水组比较均无统计学差异(P均>0.05)。结论 NCTD-GC-NPs可发挥双重肝靶向作用,显著提高药物的抗肿瘤作用,且无明显免疫抑制作用。

尿刊酸修饰的壳聚糖介导野生型p53基因转染对人肺腺癌细胞系H1299增殖和凋亡的影响

目的:研究尿刊酸修饰的壳聚糖(UAC)介导野生型p53(wt-p53)基因转染对人肺腺癌细胞系H1299(p53基因缺失)的增殖抑制和凋亡诱导作用。方法:UAC介导wt-p53基因转染H1299细胞后,采用荧光显微术、RT-PCR法和West-ernblot法分别检测细胞内绿色荧光蛋白(GFP)、wt-p53mRNA和蛋白的表达,并通过MTT法分析基因转染对细胞的生长抑制作用,DAPI染色法和琼脂糖凝胶电泳法评价其对细胞的诱导凋亡作用。结果:UAC介导wt-p53基因转染H1299细胞后,大量细胞表达GFP,细胞内wt-p53mRNA和蛋白表达水平明显上调,细胞生长受到显著地抑制,凋亡细胞数量明显增加,并有清晰的DNA梯状条带出现。结论:UAC介导wt-p53基因转染能够显著地抑制人肺腺癌细胞系H1299的增殖,并诱导其凋亡。

壳聚糖及其衍生物的修饰对pH敏感型PLGA微粒性质及其在巨噬细胞内分布的影响

研究了壳聚糖及其衍生物的修饰对pH敏感型聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)微粒性质及其在巨噬细胞中分布的影响.通过微孔膜乳化技术与复乳溶剂挥发法相结合制备了壳聚糖及其衍生物修饰的pH敏感型PLGA微粒,用单因素法对pH敏感型PLGA微粒的制备工艺进行了优化,以Bradford protein assay法测定微粒的蛋白含量,用扫描电子显微镜观察了微粒的形态结构,用马尔文粒径仪测定了微粒的粒径和zeta电位,用台盼蓝染色法测定了微粒的细胞毒性,并利用荧光标记法确定了微粒在巨噬细胞内的分布.结果发现,4种微粒粒径为1 000～1 200 nm;壳聚糖及其衍生物修饰后的微粒包封率明显上升,zeta电位显著升高,壳聚糖修饰的微粒主要分布在细胞质,而未被修饰的微粒主要分布在溶酶体内.

尿刊酸修饰壳聚糖载基因纳米复合物的制备及体外性质

制备新型壳聚糖衍生物——尿刊酸修饰壳聚糖(UAC)/质粒DNA(pDNA)纳米复合物,采用凝胶电泳阻滞实验评价UAC包裹pDNA的能力;通过对各种影响因素(包括pH、渗透压、脱氧核糖核酸酶及肝素)的考察,对该纳米复合物的稳定性进行评价;利用激光粒度仪测定该纳米复合物的粒径和Zeta电位,透射电镜对其进行形态学观察。研究结果表明,高取代度(50.0%)的载体UAC在氮磷比(N/P)≥3时将pDNA完全包裹形成纳米复合物;N/P越高,该纳米复合物对碱性环境、高渗透压、DNaseⅠ、肝素的稳定性越好;低相对分子质量壳聚糖(20 kD)的UAC能够更有效地保护pDNA免受DNaseⅠ的降解,且形成的纳米复合物较容易被肝素解聚;N/P为30的纳米复合物的粒径为125.2 nm,Zeta电位为+37.9mV,呈类球形结构。因此,高取代度、低相对分子质量壳聚糖的载体UAC与pDNA形成高N/P的纳米复合物能够具有良好的特性,适合进行细胞转染实验,有望成为一种新型载基因纳米复合物。

甘露糖修饰的壳聚糖聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球作为口蹄疫病毒核酸疫苗递送载体的特性评价

旨在对制备的甘露糖修饰的壳聚糖聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(D,L-lactide-co-glycolide),PLGA]纳米微球作为口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)核酸疫苗递送载体进行评价。采用西佛碱反应和元素分析制备具有一定取代度的甘露糖修饰的壳聚糖衍生物(mannose modified chitosan,MCS),然后,经双重乳化挥发法制备得到甘露糖修饰的壳聚糖PLGA纳米微球(MCS-PLGA-NPs)。采用纳米粒径仪检测MCS-PLGA-NPs粒径分布和表面电势(zeta)、扫描电镜考察其形态、琼脂糖凝胶电泳观察其对质粒的吸附和吸附质粒后抵抗核酸酶降解能力、CCK-8法检测MCS-PLGA-NPs的细胞毒性、激光共聚焦观察巨噬细胞对MCS-PLGA-NPs-质粒DNA复合物的摄取、荧光显微镜和Western blot验证MCS-PLGA-NPs加载质粒DNA在细胞中的表达。元素分析结果表明,成功制备了取代度为5%~10%的MCS。纳米粒径测定和扫描电镜结果表明,MCS-PLGA-NPs的zeta为正值、粒径分布均匀且形态规则呈球形。琼脂糖凝胶电泳结果显示,MCS-PLGA-NPs吸附质粒的能力随着其质量的增加而增强并且可以在一定程度上抵抗核酸酶降解质粒DNA。在细胞毒性试验中,不同浓度的MCS-PLGA-NPs与RAW264.7细胞共孵育24 h后,细胞存活率仍在85%以上。在细胞摄取试验中,用激光共聚焦显微镜可以明显观察到质粒DNA结合到纳米微球表面被RAW264.7细胞摄取。荧光显微镜和Western blot试验证明MCS-PLGA-NPs加载质粒DNA可以在细胞中进行表达。综上表明,本研究成功制备了MCS以及具有递送核酸疫苗能力的MCS-PLGA-NPs,为FMDV核酸疫苗的递送研究提供了新的方向和见解,也为该递送载体携带特定抗原靶向抗原递呈细胞表面甘露糖受体以及应用于动物免疫的研究奠定基础。

固定化脂肪酶PSL/CS-MCM-48的制备及其催化性能

用壳聚糖(CS)修饰介孔分子筛MCM-48制备了复合载体CS-MCM-48,在异辛烷中制备了固定化假单胞菌脂肪酶PSL/CS-MCM-48,研究了固定化酶的制备条件对其催化性质的影响.结果表明,固定化酶PSL/CS-MCM-48适宜的制备条件为复合载体中m(CS)∶m(MCM-48)=1∶10,m(酶)∶m(载体)=1∶10,磷酸盐缓冲溶液(PBS)的pH值为6.5,V(PBS)∶V(异辛烷)=1∶100.固定化酶PSL/CS-MCM-48催化水解橄榄油的活性达633 U/g,活力回收为55.2%,其催化活性约是PSL/MCM-48催化活性的3倍.同时考察了反应温度和反应体系的pH值对PSL/CS-MCM-48催化活性的影响规律.

重金属Pb^(2+)与蛋白质多组份体系的结合反应机制研究

滴涂法制备壳聚糖修饰电极(Chitosan/Glassy Carbon Electrode,CTS/GCE),并通过循环伏安法和电化学交流阻抗法表征修饰电极;利用修饰电极研究Pb2+离子与血清蛋白质混合体系及单组分体系的结合反应机理,并进行分析比较。结果表明,CTS/GCE修饰电极测定Pb2+-蛋白质分子相互作用时显现良好的线性响应关系,利用建议的理论方程计算了Pb2+与蛋白质的结合参数;分析实验数据表明混合组分体系中蛋白质分子间也存在相互作用,从而影响Pb2+与单组分蛋白质分子相互作用,Pb2+与多组分蛋白质溶液体系的相互作用参数不等于Pb2+与单组分蛋白质分子相互作用参数之和;同时,文章提出了一个蛋白质-蛋白质分子相互作用的计算公式,以此定量衡量多组分蛋白质混合体系中蛋白质分子间的相互作用。研究结果可为研究重金属离子与蛋白质组的相互作用提供前期基础,并为蛋白质-蛋白质分子间相互作用研究提供新方法。

脂肪酸脱氢酶基因在兔体内表达的生物学效应研究

目的研究脂肪酸脱氢酶基因在兔子体内的生物效应,探索不饱和脂肪酸与兔子免疫的相互作用。方法用壳聚糖(CS)和壳聚糖的聚乙烯亚胺(PEI)、聚乙二醇(PEG)修饰产物(mPEG-O-CS-PEI),对含有脂肪酸脱氢酶基因的真核表达质粒VRMFat-1进行包裹,肌肉注射新西兰白兔,每两周采取抗凝血,检测血液中免疫细胞数量的变化情况,利用气相色谱仪检测动物组织中脂肪酸的含量变化,并通过荧光定量PCR检测免疫细胞内免疫相关基因的表达情况。结果两组实验兔组织中的n-3不饱和脂肪酸含量显著高于对照组(P<0.05),其TLR4、CD3、IL-4和IL-6基因表达水平显著升高(P<0.05)。结论转入的脂肪酸去饱和脱氢酶基因能够在实验兔体内正常表达,初步证明不饱和脂肪酸对兔子的固有免疫和获得性免疫机能均有明显的增强作用。

两种植物甾醇纳米粒的降胆固醇效果研究

目的:研究两种植物甾醇纳米粒对高血脂小鼠的降胆固醇效果。方法:建立高血脂小鼠模型,随后将小鼠分为8组:正常组、高脂模型组、阳性对照组、植物甾醇(PS)组、植物甾醇纳米粒(PNP)组、空白纳米粒(NP)组、壳聚糖修饰植物甾醇纳米粒(CS-PNP)组、空白壳聚糖修饰纳米粒(CS-NP)组,连续干预4周。测定小鼠体重、采食量变化,脏器指数、血清指标、肝脂含量以及粪便中甾醇含量,并进行肝脏切片观察。结果:各给药组对小鼠采食量及体重无显著影响(p> 0.05);PNP和CS-PNP组小鼠肝系数较高脂组显著降低(p <0.05),心系数、脾系数显著升高(p <0.05),对肺系数和肾系数无显著影响(p> 0.05);PNP和CS-PNP组可显著降低小鼠血脂中TG、TC和LDL-C水平,升高HDL-C水平,同时显著降低肝脏中TG与TC含量(p <0.05);PNP和CS-PNP组能有效治疗小鼠的脂肪肝。结论:PNP和CSPNP对膳食诱导的高血脂小鼠有较好的降胆固醇效果。

精氨酸修饰壳聚糖提高基因转染效率的研究

富精氨酸短肽由于其独特的内在化机理而受到了广泛的关注.研究结果表明,精氨酸和胍基能有效转运穿透细胞膜,在细胞穿膜过程中扮演非常重要的角色.本文将精氨酸接枝到壳聚糖上制备了一种新型的壳聚糖衍生物——精氨酸修饰的壳聚糖(Arg-CS),并用复凝聚的方法制备了Arg-CS/DNA纳米复合物.对Arg-CS及Arg-CS/DNA复合物的物理化学性质进行了表征,并以HeLa细胞为宿主细胞研究了Arg-CS/DNA复合物的转染行为和效率.Arg-CS介导的荧光素酶质粒的表达较壳聚糖介导的荧光素酶的表达提高了大约100倍,而MTT实验表明,Arg-CS及其与DNA复合物在整个实验浓度范围内细胞毒性均很小,Arg-CS有望成为一种高效、安全的壳聚糖基非病毒载体.

载多柔比星的胆固醇修饰乙二醇壳聚糖纳米粒在荷S180瘤小鼠的组织分布

目的研究载多柔比星(DOX)的胆固醇修饰乙二醇壳聚糖纳米粒(DCN-16)在荷S180瘤小鼠体内的组织分布。方法将多柔比星和DCN-16分别给动物静脉注射给药,用高效液相色谱法测定荷瘤小鼠不同组织中多柔比星的含量,对药物的体内分布特征和靶向性进行评价。结果 DCN-16能够长时间滞留在小鼠血液中,在荷瘤鼠中的心、肺、肾中的血药浓度-时间曲线下面积(AUC0→∞)比多柔比星组显著减小(P<0.05),在肝、脾和肿瘤组织中的AUC0→∞显著增多(P<0.05)。DCN-16在肿瘤中的相对摄取率(Re)为2.56。结论应用胆固醇修饰乙二醇壳聚糖纳米粒负载多柔比星后,能够使药物在血液中长时间循环,增加肿瘤靶向治疗效果和降低心脏的毒副作用。

新型阳离子聚合物非病毒载体介导野生型p53基因体外转染效果的研究

目的:研究新型阳离子聚合物非病毒载体———尿刊酸修饰的壳聚糖(UAC)介导野生型p53(wt-p53)基因体外转染人肝癌细胞系HepG2的效果。方法:载体UAC包裹含绿色荧光蛋白(GFP)报告基因和wt-p53治疗基因的质粒(pEGFP-p53)转染HepG2细胞,利用流式细胞术和荧光显微术检测细胞内GFP的表达,优选最佳转染条件;采用RT-PCR法检测细胞内p53mRNA的表达,流式细胞术评价基因转染对细胞周期的影响,Western blot法检测细胞内p53及其下游细胞周期调控蛋白的表达。结果:在低pH(pH=6.9)条件下,采用低壳聚糖分子量(20000)的UAC作为载体,与pEGFP-p53形成高N/P(N/P=30)的UAC/pEGFP-p53复合物转染HepG2细胞,可获得最佳转染效果;载体UAC介导wt-p53基因转染细胞后,p53mRNA表达水平明显上调,G0/G1期出现显著阻滞,p53、p21和Rb蛋白表达水平明显上调,cyclin D1和CDK4蛋白表达水平明显下调。结论:载体UAC可成功介导wt-p53基因转染HepG2细胞,并诱导其产生细胞周期阻滞。

EDTA修饰的壳聚糖磁性吸附剂对当归提取液中的重金属的去除

中药提取液中的重金属不仅含量低,而且还易与提取液中的多种有机组分产生络合作用,一般很难高效脱除。该文应用EDTA修饰的壳聚糖磁性吸附剂(EDTA-modified chitosan/SiO2/Fe3O4,简称EDCMS)对当归提取液中低浓度的重金属进行了吸附脱除实验。结果表明EDCMS对提取液中低浓度的重金属如铜,镉,铅等具有很高的去除效率,其中对镉、铅的去除率可分别达到90%,94.7%。此外,EDCMS对药液中的其他重金属如锌、锰等也有一定的脱除作用,但在脱除重金属过程中,药液中的含固量、阿魏酸的含量以及HPLC指纹图谱等均无显著变化。上述实验结果提示EDCMS对重金属的去除过程不会引起当归药液中主要药效成分的变化。

TAT—LHRH修饰的壳聚糖／DNA纳米粒的细胞内吞途径

目的探索对肝癌细胞HepG2具有较高转染效率和靶向性的TAT-LHRH修饰的壳聚糖／DNA纳米粒的内吞途径。方法采用复凝集法，将荧光标记的质粒DNA与壳聚糖或TAT—LHRH修饰的壳聚糖混合制备壳聚糖／DNA纳米粒（CDN）和TAT—LHRH修饰的壳聚糖／DNA纳米粒（TLCDN）。观察3种内吞途径抑制剂Chlorpromazine、Filipin或Dynasore对HepG2细胞摄入CDN或TLCDN的影响，用高内涵采集数据并分析。结果Chlorpromazine对CDN摄人的抑制作用高于对TLCDN摄人的抑制作用，但其差异无统计学意义；Filipin明显抑制HepG2对TLCDN的摄人，但对CDN的摄入则起促进作用；Dynasore能同时抑制HepG2对上述2种纳米粒的摄入，且程度基本相同。结论肝癌细胞HepG2对CDN的摄入主要通过网格蛋白依赖性细胞内吞途径，而对TLCDN的摄入途径包含网格蛋白依赖性细胞内吞途径和小窝蛋白介导的细胞内吞途径，但以后者为主。

单精氨酸修饰壳聚糖作为基因载体的研究

目的探索一种单精氨酸取代且取代度高的精氨酸修饰壳聚糖的合成方法,并评价其作为基因载体的生物学效应.方法通过在精氨酸修饰壳聚糖的反应前后对精氨酸的氨基进行保护和脱保护的方法,制备单精氨酸修饰的壳聚糖（sAC）.按已有文献报道的方法制备刘氏精氨酸修饰的壳聚糖（LAC）.通过傅里叶变换红外光谱仪和核磁共振波谱仪验证精氨酸是否接枝于壳聚糖上.采用复凝聚法制备sAC载基因纳米粒子（sACGN）、LAC载基因纳米粒子（LACGN）和未修饰的壳聚糖载基因纳米粒子（CGN）,并对其进行表征.通过体外转染大鼠血管平滑肌细胞A10评价纳米粒子的细胞摄入量、摄入机制和基因转染效率,噻唑蓝比色法评价其细胞毒性.结果红外光谱结果证实,壳聚糖已成功接枝于精氨酸上.核磁共振波谱结果显示,sAC和LAC中精氨酸的取代度分别为21.3％和6.4％.当氮磷比（N/P）为2：1时,CGN、LACGN和sACGN的粒径分别为（94.81±2.93）nm、（124.53±2.55）nm和（128.53±2.04）nm,Zeta电位分别为（3.50±1.61）mV、（5.74±0.41）mV和（6.04±1.39）mV.CGN的细胞摄入主要通过网格蛋白依赖的内吞途径,而LACGN和sACGN的细胞摄入主要通过小窝蛋白依赖的内吞途径.与CGN相比,LACGN和sACGN的细胞摄入量和转染效率均升高,差异均具有统计学意义（均P〈0.05）;且sACGN在pH近中性环境下转染效率达到最高.噻唑蓝实验结果显示,当sACGN的质量浓度达100μg/ml时,A10细胞的存活率仍高于90％,表明sACGN几乎无细胞毒性.结论采用新方法成功合成了sAC.作为基因载体,sACGN在pH近中性环境下显示出较CGN和LACGN更高的基因转染效率和更低的细胞毒性.