烟曲霉菌壳聚糖酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

根据GenBank中发布的烟曲霉菌壳聚糖酶(Aspergillusfumigatuschitosanase,EC3.2.1.132)基因序列人工合成8条DNA长链及4条引物链。DNA链的设计上在不改变壳聚糖酶氨基酸组成的前提下选择大肠杆菌使用频率高的密码子。PCR拼接法扩增壳聚糖酶基因并克隆入pGEM-Teasy载体进行序列分析,进一步亚克隆入表达载体pGEX-3X。重组质粒pGEX-Csn转化E.coliDH5α,IPTG诱导表达,亲和层析及FactorXa酶解纯化重组Csn。所得重组壳聚糖酶具有降解壳聚糖的生物活性,其活性受温度及pH值的影响。

曲霉菌内切型壳聚糖酶基因克隆及在大肠杆菌中的表达

背景:壳聚糖酶是高效、特异降解壳聚糖的酶,因此高效稳定地表达具有较高活性的壳聚糖酶可有效提高壳聚糖介导的基因治疗效果。目的:构建一种可高效降解壳聚糖的壳聚糖酶基因,探讨其在大肠杆菌中的表达及影响其活性的主要因素。方法:根据GenBank公布的曲霉菌CJ22-326内切型壳聚糖酶基因序列信息(EU302818),设计并合成23条重叠引物,PCR法扩增壳聚糖酶基因片段,构建原核表达质粒pET28a-His6-CSN,将其转化大肠杆菌,收集融合蛋白His6-CSN,检测融合蛋白的表达及酶活性,同时检测不同pH值及温度对壳聚糖酶活性的影响。结果与结论:Western-blot证实融合蛋白His6-CSN成功表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测显示表达的融合蛋白相对分子质量约为29 000,二硝基水杨酸比色法测定壳聚糖酶对壳聚糖的降解活性显著高于溶菌酶(P<0.05),但低于灰色链霉菌壳聚糖酶(P<0.05)。壳聚糖酶的最适pH值和最适温度分别为6.0和50℃,当pH值在4.0-7.0、温度在30-50℃范围内具有较高的酶活性。

壳聚糖酶基因片段的克隆及序列分析

由GenBank上发布的壳聚糖酶基因编码区序列设计PCR扩增引物,从笔者所在实验室已筛选的1株具有降解壳聚糖功能的芽孢杆菌中克隆得到壳聚糖酶基因片段,将该片段与pMD20-T载体连接后转化至大肠杆菌DH5α中,测序并与NCBI上已发布的芽孢杆菌属壳聚糖酶编码区序列进行比对分析。结果表明,该片段与来自糖苷水解酶46家族中的Bacillus circulans MH-K1和Bacillus ehimensis EAG1的壳聚糖酶编码区序列同源性分别为71.75%和75.93%;与糖苷水解酶8家族中的Bacillus sp.No.7-M的壳聚糖酶编码区序列同源性为87.73%。初步推断该片段为类似壳聚糖酶基因片段。