壳聚糖-丝素合金膜的制备及性状研究

以壳聚糖和丝素 2种高分子物质溶液按最适比例混合 ,再加入戊二醛后 ,在聚乙烯薄膜上均匀涂布 ,真空干燥成合金膜 ,并对合金膜的外观、溶胀度、酶固定化效果等性状做了研究 .结果表明 ,壳聚糖 丝素合金膜的柔韧性好 ,在不同pH值下的溶胀度稳定 ,具有亲水性强 ,含游离氨基多等优点 。

壳聚糖-丝素支架与真皮间充质干细胞的体外复合培养

背景：壳聚糖与丝素有各自的优点和不足,将两者共混,可取长补短,改善性能。进行壳聚糖-丝素支架与真皮间充质干细胞体外复合培养的研究,可进一步为工程化组织构建打下基础。目的：将壳聚糖-丝素支架与大鼠真皮间充质干细胞体外复合培养,探讨壳聚糖-丝素支架对真皮间充质干细胞吸附、生长及增殖的影响。方法：①壳聚糖和丝素以质量比为3︰7充分搅拌混匀,冻干制作壳聚糖-丝素海绵状支架,并测其孔径、孔隙率等指标。②将该支架与大鼠真皮间充质干细胞复合进行体外培养,倒置相差显微镜观察细胞与支架复合生长、基质形成以及细胞与支架结合的情况。分别于培养6,12,24h消化支架上的细胞,计算细胞吸附率。于培养2,4,6,8,10d后,用MTT法检测细胞增殖率情况。以无支架的细胞培养作为对照组。结果与结论：①倒置相差显微镜及扫描电镜下观察发现该支架有分布较均匀且细密的小孔,孔与孔之间相互连通,孔径大小较均匀,孔径在100~150μm之间,孔隙率为90.3%。②24h内,真皮间充质干细胞对支架的黏附率随着时间的增加而逐渐增高,24h时的黏附率为93%,表明真皮间充质干细胞可良好地黏附于壳聚糖-丝素支架上。③MTT法检测细胞增殖结果显示,于培养各检测时间点,实验组与对照组比较差异均无显著性意义。于培养早期（第2,4天）,对照组增殖细胞数略高于实验组;于培养第10天,实验组的增殖细胞数略高于对照组。倒置相差显微镜观察细胞于支架上的形态和附着良好,并有较旺盛的细胞基质分泌。表明真皮间充质干细胞在该支架上能良好地生长、增殖。提示壳聚糖-丝素支架是真皮间充质干细胞体外培养的良好支架材料。

负载TGF-β_1微球的壳聚糖-丝素支架复合骨髓间充质干细胞修复兔关节软骨缺损的实验研究

目的研制负载转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)壳聚糖微球的壳聚糖-丝素支架复合骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)体外构建组织工程软骨,观察将其移植修复兔膝关节软骨缺损的效果。方法通过密度梯度离心法及贴壁培养法分离纯化MSCs,以抗兔CD14、CD44等单抗采用流式细胞仪进行MSCs表面抗原鉴定,获得纯化的MSCs。采用乳化交联法获得包裹TGF-β1壳聚糖缓释微球,并将该微球负载在冷冻干燥获得的壳聚糖-丝素支架上。将培养的MSCs种植到支架上,体外构建组织工程软骨,移植到兔关节软骨缺损处。移植空白支架的为实验对照组,移植体外构建的组织工程软骨为实验组。主要观察指标,流式检测的MSCs细胞表面标记情况,微球的形态,支架与细胞共培养后电镜下情况,支架移植后的兔关节修复情况及组织学检查。结果流式检测MSCs第4代及第9代细胞的CD14及CD44表面抗原的表达情况发现两代MSCs CD14表达基本呈阴性,CD44表达呈阳性,符合间充质干细胞的特性。扫描电镜观察所制备的微球基本呈球形,表面光滑,直径约为1μm,大小较均一,分散度好。细胞在壳聚糖-丝素三维支架上生长状态良好,电镜观察,可见支架孔隙内有细胞黏附生长。移植治疗后发现实验组修复明显好于对照组,实验组术后3个月实验组已经有较硬的类软骨组织填充修复,切片显示有软骨细胞规则排列,甲苯胺蓝染色为阳性,而对照组仅为纤维组织修复,切片显示为纤维组织或纤维软骨组织修复,软骨细胞排列紊乱,甲苯胺蓝染色阴性或弱阳性。结论负载TGF-β1壳聚糖微球的壳聚糖-丝素支架复合骨髓间充质干细胞体外复合培养后移植治疗修复兔膝关节软骨缺损,具有较好的疗效。

壳聚糖-丝素复合支架材料与骨髓间充质干细胞相容性的研究

目的:探讨壳聚糖-丝素复合支架材料与骨髓间充质干细胞(BMSCs)的细胞相容性。方法:冻干法制备壳聚糖-丝素共混多孔支架,其孔径在100μm～160μm之间,孔隙率为84.2%。将骨髓间充质干细胞与支架复合进行体外培养。倒置相差显微镜与扫描电镜观察BMSCs细胞与支架复合生长、基质形成以及细胞与支架结合的情况,计算细胞黏附率。并于培养2 d、4 d、6 d、8 d、10 d后,用MTT法检测细胞增殖率情况。以不加支架只接种细胞为对照组。结果:BM-SCs在壳聚糖-丝素支架上培养24 h时的黏附率达94.3%,表明具有良好的黏附作用。MTT法检测结果表明BMSCs在壳聚糖-丝素支架上能良好地生长、增殖,细胞生长曲线相似于对照组。相对于对照组,实验组的相对增殖率在86.1%～98.2%之间。倒置相差显微镜及扫描电镜观察显示BMSCs在壳聚糖-丝素支架上能良好地生长、增殖及分泌基质,以及维持细胞的正常形态。结论:壳聚糖-丝素支架与骨髓间充质干细胞具有良好的细胞相容性,壳聚糖-丝素复合支架是一种很有潜力的组织工程支架材料。

丝素-壳聚糖合金膜固定化超氧化物歧化酶的研究

采用富含自由氨基的丝素 壳聚糖合金膜为载体,吸附固定从柞蚕蛹提取分离的超氧化物歧化酶(SOD),研究并确定了固定化的最佳条件,分别为酶浓度38U/mL、pH6 3、温度4～8℃、时间15h.制得的固定化酶活力为89 1U/g载体,酶的活力回收达到35 9%.

丝素-壳聚糖神经导管修复兔面神经缺损的神经电生理变化

目的探讨丝素-壳聚糖混合膜用于面神经缺损修复的可能。方法成年雄性日本大耳白兔20只,切断双侧面神经颊支,制成10mm的兔面神经颊支缺损模型。将丝素-壳聚糖混合膜制作成神经导管,用来修复兔右侧面神经缺损,作为实验组;左侧用翻转自体神经修复,作为对照组。术后2,4,6,8周显微镜下观察面神经修复段的解剖形态,术后4,6,8周行神经电生理检查。结果随时间推移,兔面神经缺损成功再生。结论丝素-壳聚糖神经导管可有效促进兔面神经缺损修复并引导神经再生。神经电生理检查可有效地反映神经缺损修复的功能性变化。

丝素-壳聚糖共混膜的物理性能和细胞相容性探讨

采用共混法制备丝素-壳聚糖共混膜,并测定其力学性能,结果表明各种配比的丝素-壳聚糖共混膜均具有良好的机械性能,能够克服纯丝素膜刚而脆的弱点。扫描电镜显示纯丝素膜SF、共混膜SCP1表面致密光滑,SCG2、SCP2两种共混膜都有明显突起,而共混膜SCG1的表面凹凸不平。细胞培养结果显示,SCG1、SCG2、SCP1和SCP2等4种共混膜的细胞毒性都在0、1级,细胞增殖率在85%～105%之间,细胞附着率在24 h的达到90%以上,说明各种配比的丝素-壳聚糖共混膜都具有良好的细胞相容性,基本符合生物材料的应用要求。

丝素-壳聚糖共混膜与颌下腺细胞体外复合培养的实验研究

目的探讨丝素-壳聚糖共混膜(silkfibroin-chitosan blend,SFCS)与颌下腺细胞体外复合培养的可行性。方法体外原代培养SD大鼠颌下腺细胞(Rat submandibular gland cells RSMG-cell)并传代,将浓度为2.0×104个/ml的第2代颌下腺细胞接种于5mm×5mm×2mm丝素-壳聚糖共混膜上体外复合培养。观察颌下腺细胞附着率和增殖情况,扫描电镜观察细胞超微结构,分别取复合培养1～10d的培养上清液,测定淀粉酶含量。结果颌下腺细胞24h附着率大于90%,生长、增殖情况良好。扫描电镜下可见复合培养7d的颌下腺细胞在丝素-壳聚糖共混膜上伸展充分,表面有许多分泌颗粒。随着复合培养时间的延长,细胞上清液中淀粉酶含量有不同程度的增加。结论颌下腺细胞与丝素-壳聚糖共混膜复合培养,颌下腺细胞附着、增殖能力及分泌功能良好,丝素-壳聚糖共混膜可以作为颌下腺组织工程的支架材料进行进一步的研究。

丝素-壳聚糖神经导管修复兔面神经缺损的实验研究

目的:探讨应用丝素-壳聚糖混合膜(silk fibroin-chitosan blend,SFCS)导管移植修复周围神经缺损的效果。方法:选取健康成年雄性日本大耳兔21只,切断双侧面神经颊支,制成8mm的兔面神经颊支缺损模型。使用丝素-壳聚糖混合膜神经导以修复兔右侧面神经缺损,作为实验组;左侧用翻转自体神经修复,作为对照组。术后4、6、8周行神经电生理检查,2、4、6、8周显微镜下观察大体形态,取材行HE及甲苯胺蓝染色组织学检查,并应用图像分析系统进行图像分析。结果:SFCS导管修复组的神经传导速度达到(27.50±3.00)m/s,单位面积(5μm2)的轴突计数为(741.80±49.92),髓鞘厚度达到(12.71±0.42)pm,与自体神经修复组比较差异没有统计学意义(P>0.05)。结论:SFCS神经导管具有促进神经轴突再生的作用,有望成为自体神经移植的替代材料应用于周围神经缺损的修复。

丝素-壳聚糖支架对骨髓间充质干细胞黏附、增殖和成骨分化的影响

目的评价丝素-壳聚糖(SF-CS)支架对骨髓间充质干细胞(BMSCs)黏附、增殖和成骨分化的影响。方法采用冷冻干燥法制备SF-CS支架并进行物理性能表征。将BMSCs接种到SF-CS支架上作为实验组,以直接接种于培养皿中的BMSCs作为对照组。通过扫描电镜观察细胞在支架上的黏附情况;采用CCK-8法检测BMSCs的细胞增殖;采用荧光实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测BMSCs成骨分化相关基因的表达水平。结果BMSCs沿SF-CS支架三维多孔结构黏附。实验组细胞增殖及成骨分化相关基因的表达水平均高于对照组,差别具有统计学意义(P<0.05)。结论SF-CS支架影响BMSCs的黏附形态,促进BMSCs的增殖和成骨分化。

四种显微技术观测大鼠颌下腺细胞与丝素-壳聚糖体外共培养的形态学特点

目的采用倒置显微镜、扫描电镜(scanning electron microscopy,SEM)、荧光显微镜和激光共聚焦显微镜((laser scanning confocal microscopy,LSCM))技术对大鼠颌下腺细胞(rat submandibular gland cells,RSMGs)与丝素-壳聚糖(silk fibroin-chitosan,SFCs)的体外复合培养进行形态学观察。为观测、评估种子细胞在三维支架的内部生长情况提供技术支持。方法取0～8 d龄SD大鼠的颌下腺,对大鼠颌下腺细胞进行原代培养、分离纯化并传代;用抗细胞角蛋白单克隆抗体(CK8)及淀粉酶抗体的免疫细胞化学染色鉴定细胞来源。选取传至第二代的对数生长期的RSMGs作为种子细胞,选取SFCs共混膜(5×5×2)mm作为支架材料构建组织工程化涎腺样结构。将种子细胞与支架材料复合培养并分别于倒置显微镜、SEM、荧光显微镜和LSCM下观察二者复合生长情况。结果倒置显微镜可以直接观察活细胞与支架复合生长情况,方法简单易行。SEM可以较精确的展示细胞支架复合生长的表面超微结构。经过荧光染料的着色,荧光显微镜和LSCM都可以观察到支架上锚定的种子细胞。荧光显微镜可见细胞核的荧光信号均匀的分布在支架孔隙内。LSCM通过层扫描及三维重建技术对较厚的标本获取图像;并可以通过旋转图像,从不同角度观察细胞支架复合物的三维剖面或整体结构,得到更为准确的定位信息。结论四种显微技术均可应用于RSMGs与SFCs体外共培养的形态学观测。LSCM的三维重建技术结合荧光染料标记可以较好地获得RSMGs与SFCs复合生长的情况,有着较广泛的应用价值。

一种5-氟尿嘧啶的丝素蛋白-壳聚糖微囊的制备

本文以丝素／壳聚糖为囊材，5-氟尿嘧啶（Fluorouracil，5-FU）为模型药物，采用复凝聚法制备5～FU-丝素蛋白-壳聚糖微囊。以包封率为指标，采用L9（3^4）正交设计及方差分析对微囊的制备工艺进行优化。利用扫描电镜和动态透析法分别研究不同因素对微囊的成囊，形貌及体外释药的影响。结果表明，所优化的制备工艺简单，制备的微囊形态规整，成囊性及分散性良好。不同因素对微囊的性能影响各不相同。5-FU-丝素蛋白-壳聚糖微囊在72h左右药物释放速度达到平衡，累计释药率约为56．41％，释药速度较药粉和壳聚糖微囊缓慢，具有较好的缓释效果。

骨组织工程中丝素蛋白-壳聚糖支架材料研究进展

随着骨组织工程研究的迅速发展,寻求能够作为细胞移植及引导新骨生长的支架,以充当细胞外基质的替代物成为研究的主要热点之一。目前国内外学者尝试利用生物材料复合技术,通过调节复合材料的比例及相应的组合方式使其发挥各自的优点,进而制作出理想的支架材料。本文分别就丝素蛋白、壳聚糖以及丝素蛋白-壳聚糖复合生物材料的结构、性能及其在骨组织工程的应用做一综述。