大鼠脂肪干细胞在纳米羟基磷灰石-壳聚糖-果胶/壳聚糖-明胶支架的成骨向分化研究

目的探索纳米羟基磷灰石-壳聚糖-果胶/壳聚糖-明胶(nHCP/CG)支架对大鼠脂肪干细胞(r ADSC)定向成骨分化的影响,为其临床应用提供理论支持。方法选择SD成年大鼠5只,体质量60~80 g,雌雄不限。从SD成年大鼠两侧腹股沟脂肪组织原代分离、培养并鉴定r ADSC,然后将其接种在nHCP/CG支架材料上,并以壳聚糖-明胶(CG)支架为对照。通过四甲基偶氮唑盐(MTT)法、Live/Dead及苏木精-伊红(HE)染色法评价支架的细胞相容性;在添加和不添加成骨诱导剂培养条件下,以碱性磷酸酶(ALP)活性及多种免疫组织化学染色测定r ADSC在nHCP/CG支架中的成骨分化行为。结果r ADSC具有间充质干细胞的特性,其在nHCP/CG复合支架材料上活性较好。nHCP/CG支架较CG支架更利于r ADSC的黏附和增殖;r ADSC在nHCP/CG支架中培养1 d、3 d、7 d时细胞数量明显高于CG支架中的细胞数量(0.432±0.028 vs 0.174±0.004、0.532±0.017 vs 0.291±0.023、0.595±0.014 vs 0.754±0.038)且差异有显著统计学意义(P<0.01)。r ADSC在nHCP/CG支架和CG支架中培养14 d和21 d均表现出较高的ALP活性;第14天时,在CG支架诱导培养细胞的ALP活性大于常规培养(0.298±0.029 vs 0.224±0.008),差异有统计学意义(P<0.05);在nHCP/CG支架中培养14 d和21 d的细胞加入诱导剂(0.224±0.006 vs 0.271±0.010、0.181±0.012 vs 0.209±0.009),ALP活性小于常规培养且差异有统计意义(P<0.05)。无论是否添加成骨诱导剂,接种在nHCP/CG支架上的r ADSC茜素红染色、Von Kossa染色、Ⅰ型胶原及Ⅷ因子免疫组化染色均表达为阳性,说明nHCP/CG支架能够自发促进r ADSC向成骨细胞分化。结论r ADSC可作为骨组织工程的种子细胞;nHCP/CG支架材料能够提供支持r ADSC黏附和生长的微环境,具有良好的生物相容性,更为重要的是能够自发诱导r ADSC定向成骨分化,有望成为一种应用于临床的骨组织工程支架材料。

壳聚糖-明胶支架／滑膜干细胞的相容性

目的检测壳聚糖-明胶支架与人滑膜干细胞（SMSCs）的相容性。方法接种滑膜干细胞于壳聚糖-明胶支架上，于第3、7和10天进行扫描电镜观察和噻唑蓝（MTT）分析。结果扫描电镜显示支架上有大量滑膜干细胞生长，且细胞形态与对照组无明显差异，MTr分析显示支架组的A值关系为10d（1．43±0．11）≥7d（1．35±0．08）〉3d（0．43±0．08），且第7、10天组的A值明显大于同期对照组（0．64±0．15、0．59±0．13）（P〈0．05）。结论壳聚糖-明胶支架与滑膜干细胞的相容性良好。

壳聚糖-明胶-碱性成纤维细胞生长因子三维大孔支架对骨髓间充质干细胞增殖的影响(英文)

背景:干细胞的分化潜能与培养条件有密切关系,改变支架材料的表面特性,三维结构,增加生长因子均可实现对干细胞增殖分化的控制。目的:制备适合骨髓间充质干细胞附着生长的、具有最佳孔隙率和孔隙结构的药物缓释组织工程支架——三维大孔支架,提供能促进多能干细胞生长的微环境。设计:重复测量设计。单位:广州中医药大学基础医学院解剖教研室。材料:实验所用健康成年SD大鼠由广州中医药大学实验动物中心提供。壳聚糖、碱性成纤维细胞生长因子购自Sigma公司。方法:实验于2003-03/2006-12主要在广州中医药大学基础医学院解剖教研室完成。采用冷冻干燥的方法,用不同比例的壳聚糖-碱性成纤维细胞生长因子-明胶依次混匀,通过控制冷冻、复温和干燥时间处理使其具有最佳孔隙率和孔结构,制备具缓释碱性成纤维细胞生长因子功能的三维大孔支架。取SD大鼠股骨和胫骨骨髓,分离、培养骨髓间充质干细胞并移植于缓释碱性成纤维细胞生长因子的三维大孔支架上进行三维培养,与无碱性成纤维细胞生长因子的支架对照。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。主要观察指标:用ELISA和扫描电镜观察支架的三维结构和缓释性能,用苏木精-伊红染色、MTT、细胞计数及扫描电镜方法观察缓释碱性成纤维细胞生长因子的三维大孔支架对骨髓间充质干细胞生长状态和细胞活力的影响。结果:含有碱性成纤维细胞生长因子的三维大孔支架有碱性成纤维细胞生长因子缓释性能,孔隙尺寸与不含碱性成纤维细胞生长因子的支架三维结构相比,差异无显著性意义(P>0.05)。含有碱性成纤维细胞生长因子的三维大孔支架能提高在支架上立体培养的骨髓间充质干细胞存活率,促进骨髓间充质干细胞黏附、增殖和活力,与不含碱性成纤维细胞生长因子的支架相比,差异有显著性意义(P<0.05)。结论:含有碱性成纤维细胞生长因子的三维大孔支架能缓释碱性成纤维细胞生长因子,有利于在支架上立体培养的骨髓间充质干细胞存活,为其在组织工程中的应用打下基础。

静电纺丝壳聚糖-明胶复合纤维的制备和体外生物相容性评价

目的采用静电纺丝技术制备壳聚糖-明胶复合纤维,体外评价其生物相容性。方法采用扫描电镜(SEM)观察纤维支架的表面形貌,考察纺丝溶液浓度、黏度以及壳聚糖/明胶质量比对纤维直径和结构的影响。将人成纤维细胞接种在纤维支架表面,绘制细胞生长曲线,观察细胞在支架表面的形态。结果通过静电纺丝技术,制备的壳聚糖-明胶复合纤维均匀、光滑,无珠状结构,纤维平均直径为600 nm～1.6μm。随着纺丝溶液浓度和黏度增加,纤维平均直径增大;随着壳聚糖/明胶质量比增加,纤维直径也随之增大。成纤维细胞在复合纤维支架上生长良好,增殖快,并且保持较好的成纤维细胞形态。结论通过静电纺丝技术制备的壳聚糖-明胶复合纤维具有良好的生物相容性,有望作为皮肤组织工程的支架材料。

C-G-Ha-HS支架改性协同原儿茶酸对NS/PCs粘附及定向分化的影响

通过层粘连蛋白（LN）对壳聚糖-明胶-透明质酸-硫酸肝素（C-G-Ha-HS）复合支架进行修饰,提高支架粘附率,优化神经干/祖细胞（NS/PCs）三维培养体系,同时考察了原儿茶酸（PCA）对三维条件下NS/PCs分化为多巴胺（DA）能神经元的影响。扫描电镜观察及CCK-8分析表明,C-G-Ha-HS复合支架孔径为90~130μm,孔隙内的NS/PCs伸出类似神经样的突触使支架与细胞相互连接形成网状结构;培养4 h后,LN修饰的C-G-Ha-HS（5：5）支架细胞粘附率增加至未修饰组的（113.53±4.32）%;培养96 h后,细胞活率增加至未修饰组的（120.30±6.65）%;免疫细胞化学鉴定表明,1%胎牛血清（FBS）和0.06 mmol·L-1 PCA协同作用,明显提高了NS/PCs向DA能神经元分化率,TH阳性细胞分化率达到（16.53±0.65）%,增加至空支架组的（172.72±6.79）%;Nurr1阳性细胞分化率达到（15.93±0.91）%,增加至空支架组的（181.23±1.04）%;研究结果为PCA应用于NS/PCs移植治疗PD提供了实验依据。

壳聚糖-明胶多孔复合支架构建自体组织工程化软骨组织的实验研究

目的 探讨壳聚糖 明胶多孔复合支架作为软骨组织工程支架的可行性。方法 消化分离猪耳廓软骨细胞 ,接种于自制壳聚糖 明胶多孔复合支架上培养 1周 ,将细胞 生物支架复合物种植于猪自体腹外侧壁皮下 ,第 10、16周取材 ,分别从大体、组织学、Ⅱ型胶原免疫组化和生物化学对再生软骨组织进行评价。结果 HE染色见 10周时有软骨组织形成 ,所形成的软骨组织见软骨细胞均匀分布 ,包埋在软骨陷窝内 ,还可见未降解的支架材料。 16周时软骨组织完成成熟 ,软骨细胞包埋在软骨陷窝内 ,支架材料完全降解 ,结构与正常软骨组织相似。Masson′strichrome染色见所形成的软骨组织间质中都有被染成绿色的胶原分布。Vehoeff染色见 16周时形成的软骨间质内含大量被染成蓝黑色弹性纤维。免疫组化证实形成的软骨组织有Ⅱ型胶原分布 ,生物化学证实所形成的软骨组织的蛋白聚糖含量与正常猪耳软骨的含量接近。结论 利用自制壳聚糖 明胶多孔复合支架上可在具有免疫功能的自体动物内形成软骨组织 ,但形成的软骨不充分 ,壳聚糖 明胶多孔复合支架有以作为软骨组织工程支架的应用前景。