吗啡增强备用根大鼠脊髓后角组织提取液对培养鸡胚背根节的促神经突起生长的作用

用组织培养方法，探讨备用很大鼠手术侧和非手术侧脊髓后角组织提取液对鸡胚背根节（ＤＲＧ）神经突起的促生长作用，以及应用吗啡对此作用的影响。结果显示：备用根大鼠手术侧脊髓后角组织提取液作用的ＤＲＧ神经突起密度（３６．４２±４．６９），比非手术侧的（２３．９６±３．４７）明显增大。提示去初级传入纤维的脊髓后角组织具有促进ＤＲＧ神经突起生长的神经营养活性作用。应用吗啡的备用根大鼠手术侧脊髓后角组织提取液作用的ＤＲＧ神经突起密度（６４．１９±９．２４），又比备用根大鼠手术侧的大。这表明，吗啡具有进一步增强去初级传入纤维支配的脊髓后角组织提取液促进培养的ＤＲＧ神经突起生长的效应。

吗啡对备用根大鼠背根节神经元胞体的影响──光镜和电镜观察

用光镜体视学方法，结合电镜观察，探讨发生侧支出芽和重建突触的背根节神经元，其胞体是否也呈现相应的形态变化，以及吗啡对这些变化的影响。吗啡备用根组和备用根对照组的大鼠术侧背根节体积与非术侧比较，均没有明显的统计学差异；其亮神经元胞体、胞核和核仁的体积也没有显著性差异。对照组非术侧亮神经元胞体的尼氏体呈颗粒状，多聚核糖体聚集成小簇，分散在胞质中。术侧尼氏体则呈小块状，多聚核糖体簇较大，较为密集。吗啡组术侧亮神经元胞体的尼氏体也在胞核周围聚集成小块状，有些还呈斑块样。此时可见多聚核糖体呈团簇状，其分布更为密集。这种变化可能与发出有髓传入纤维的亮神经元在脊髓内侧支出芽及重建突触有关。对照组术侧暗神经元胞体、胞核和核仁的体积，比非术侧显著增大。吗啡组术侧暗神经元胞体、胞核和核仁的体积又比对照组术侧的大，而且胞质的多聚核糖体和粗面内质网明显增多，表明与无髓传入纤维在脊髓侧支出芽及重建突触有关的暗神经元胞体也发生了相应的形态变化，吗啡对这些变化有明显的促进作用。

备用根大鼠脊髓后角提取液中神经营养活性组分的分离及生物活性测定

制作备用根大鼠脊髓后角提取液，取其分子量大于10kD的组分进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，发现手术侧和非手术侧的电泳区带数目大致相同，但手术侧样品的第四条蛋白质区带扫描的吸收峰面积百分比大于非手术侧样品的第四条区带，两者在量上可能有差别。将手术侧样品经交联葡聚精G-75凝胶层析，得到两个洗脱峰．第一峰洗脱液有促进体外培养的背根节神经元存活及其突起生长的作用，其电泳分析显示4条主带，分子量在40～80kD之间．实验结果提示部分去传入纤维支配的脊髓后角组织含有神经营养活性物质，该物质的分子量约在40～78kD之间．

备用根大鼠脊髓后角组织的两种分子量组分提取液对培养的鸡胚背根节神经元神经突起生长的影响

应用Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ－１０微浓缩器和组织培养方法，探讨备用根大鼠手术侧和非手术侧脊髓后角组织小于１０ｋＤ和大于１０ｋＤ两种分子量组分提取液对鸡胚背根节神经元的神经突起的促生长作用。结果显示：给予备用根大鼠手术侧脊髓后角组织大于１０ｋＤ组分的提取液时，背根节神经元的神经突起密度较非手术例小于１０ｋＤ组分、非手术侧大于１０ｋＤ组分和手术侧小于１０ｋＤ组分者密度明显增大．提示部分去传人纤维支配的脊髓后角组织大于１０ｋＤ组分的提取液，可能含有某些促进培养鸡胚背根节神经元神经突起生长的神经营养物质．

备用根手术对背角组织促神经突起生长活性的影响

将５只单侧后肢备用根术后５天猫的背角组织提取液用于培养鸡胚背根节及电泳分析。手术组（手术侧）提取液大于５０ＫＤ组份培养的背根节的神经突起明显长于非手术组（非手术侧）者，提示手术组此组份的促神经突起生长活性显著增强；该组份各电泳带的吸收光谱显示，手术组迁移率为０．１的蛋白带的吸收峰面积百分比明显增大，而迁移率为０．５的蛋白带的吸收峰面积百分比则明显减小，表明手术组提取液大于５０ＫＤ组份中此两带的蛋白质含量分别有所增减。推测可能系备用根手术导致提取液大于５０ＫＤ组份中某一促神经突起生长活性物质含量增加，而另一抑制神经突起生长物质含量减少，从而导致背角组织促神经突起生长活性的增强。

针刺备用根猫背角组织中促神经突起生长活性物质的研究

本组既往研究发现，针刺备用根猫脊髓背角组织提取液大于50KD组份内存在促神经突起生长的神经营养活性物质。本实验采用双侧备用根猫模型（切除双侧L1～L5，L7～S2背根节，保留L6为备用根），每日针刺动物一侧L6脊神经支配范围的足三里与悬钟、伏兔与三明交两组穴位之一，以进一步证实针刺时该类神经营养活性物质的影响。术后5天取双侧T12～SZ脊髓背角组织，匀浆、离心后，取上清液进行电泳分析，并与鸡胚背根节（DRG）联合培养。结果显示：1．对聚丙烯酸胺梯度电泳的电泳谱分析，发现在相对迁移率（RM）0．11带的蛋白质，针刺侧吸收峰面积百分比（11．78±1．08％）较非针刺侧（10．12f0．83％）明显增高（P＜0．05）。2．取RM0．11带及空白凝胶小片分别与DRG联合培养，48小时后测量DRG神经突起平均长度。发现针刺侧（22043±6．01pm）、非针刺侧（187．08±8.01pm）、以及参照组（15577±2.04pm）之间均存在明显差异。以上结果提示，部分去传入猫背角组织中存在某种促神经突起生长的神经营养活性物质，针刺通过增加该活性物质的含量来加强这种促神经突起生长效应。由此推测，部分去传入和针刺引起的这类神经营养活性物质的含量增加，可能与备用根猫在体的侧支出芽有关。

吗啡对备用根大鼠脊髓Ⅱ板层背根终未的影响——抗氟化物酸性磷酸酶组化定量研究

应用酶组化方法和图象分析探讨脊髓Ⅱ板层无髓传入纤维终末标记物——抗氟化物酸性磷酸酶(fluoride-resistant acid phoshatase,FRAP)活性的变化,从而了解吗啡对备用根大鼠的侧支出芽有无促进作用。结果显示:备用根大鼠手术侧L_3、L_4和L_5节段Ⅱ板层FRAP阳性反应物面积因切除了大部分腰段背根于17天时下降到最低水平,于34天时L_3平面开始回升,即其阳性面积比17天时增大5倍多。吗啡备用根大鼠17天时其术侧Ⅱ板层阳性反应物面积也降到最低水平,唯L_3Ⅱ板层的阳性面积比17天备用根者大4倍,表明17天时阳性面积已开始回升;而到34天时术侧L_4Ⅱ板层阳性面积比17天时增大75％,比34天备用根大鼠增大一倍。表明吗啡促进了背根无髓纤维的侧支出芽,而出芽的纤维更快地分布到L_4节段,稍后也分布到L_4节段Ⅱ板层。

吗啡备用根大鼠脊髓组织神经营养活性物质的分离纯化和生物活性测定

目的 分离纯化吗啡备用根大鼠脊髓组织提取液 ,以期获得某些神经营养活性物质。 方法 应用SephacrylS 2 0 0HR凝胶层析、高效液相色谱 (HPLC)和组织培养等技术分离和检测神经营养活性物质。 结果 备用根大鼠脊髓组织提取液能够促进体外培养的鸡胚背根节 (DRG)神经突起的生长 ;吗啡作用的大鼠脊髓组织提取液也具有同样的作用 ,但备用根大鼠和吗啡作用的大鼠脊髓组织提取液在促神经突起生长作用方面并没有明显的差异。吗啡备用根大鼠脊髓组织提取液具有明显的神经营养活性作用。吗啡备用根大鼠脊髓组织提取液的SephacrylS 2 0 0HR凝胶层析Ⅱ峰洗脱液和Ⅳ峰洗脱液能够促进DRG神经突起的生长。经SDS PAGE分析 ,Ⅱ峰洗脱液呈现 1条分子量约为 6 5kD的蛋白质主带 ,Ⅳ峰洗脱液的蛋白质成分较为复杂。应用HPLC对凝胶层析Ⅳ峰洗脱液作进一步的分离 ,发现HPLCA峰洗脱液能够促进DRG神经突起的生长。经SDS PAGE显示 ,A峰洗脱液的两条蛋白质主带分子量分别为 30kD和 18kD。 结论 吗啡备用根大鼠脊髓组织提取液中具有神经营养活性作用的物质可能是分子量约为 6 5kD、30kD和

备用根猫脊髓背角提取液对鸡胚背根节神经细胞存活的影响

本研究组既往的研究表明，备用根猫脊髓背角组织块和提取液促神经突起生长的活性明显增强。为观察去传入猫脊髓背角提取液对神经元存活的影响，我们采用单侧后肢备用根猫（切除一侧Ll－L。、L，－Sz背报节，保留L。背根为备用根）五只，分别取术后五天T12-S3节段脊髓背角组织，匀浆、离心获得上清液、制成条件培养液后，加入鸡胚背根节神经细胞是液培养。于48h时，以l％台盼蓝染色，计数神经细胞存活率。结果显示：手术侧组神经细胞存活率为0.85±0.04，而非手术侧组神经细胞存活率仅为0．55fo．10。两者相比有显著性差异（P＜0．of）。提示备用根猫脊髓背角提取液对培养中的鸡胚背报节神经元除有促进神经突起生长的作用外还有明显的促神经元存活作用。

针刺备用根猫脊髓背角组织促神经元存活活性的研究

本研究组已证实，部分去传入猫脊髓背角组织提取液中存在某种促神经元存活的神经营养活性物质。为了探讨针刺对该活性物质含量及其对神经元存活的影响，作者采用5只双侧备用根猫（切除双侧Ll～L5，L7～S2背根节，保留L6为备用根），每日针刺一侧L6背神经支配范围内的两组穴位（足三里与悬钟、伏兔与三阴交）之一，术后5天分别取双侧T12～S2背角组织，匀浆、离心，取上溶液进行电泳和细胞培养。经聚丙烯酸胺梯度电泳后行光密度扫描，发现针刺侧相对迁移率（RM）0.11蛋白带的吸收峰面积百分比（11．78±l．08％）较非针刺侧着（10．12±0.83％）明显增高（P＜0.05），表明针刺使RM0．11带蛋白质的含量增加。用本组建立的简易细胞钓蛋白带法将鸡胚背根节（DRG）的神经细胞悬液倒于电泳凝胶条上进行培养，发现凝胶条上RM0.11蛋白带所在区域内（RM0．10～0．13），有密集的神经细胞贴附。恒定面积由（1．02×104μm2／视野）内，针刺侧平均细胞数（19．09±2．12个）较非针刺侧者（8．64±1．12个）明显增多（P＜0．05）。聚丙烯酸胺梯度电泳测定分子量后显示RM0．11带蛋白质分子量约为130KD左右。上述结果表明，部分去传入猫背角组织中分子量约130KD左右的蛋白质具有营养DRG神经元的作用，针刺可能通过该类?

吗啡备用根大鼠脊髓后角提取液两种分子量组分的生物活性测定及其电泳分析

目的 探讨备用根大鼠手术侧和非手术侧脊髓后角组织 >10 k D和 <10 k D两种分子量组分提取液 ,对鸡胚背根节 (DRG)神经突起的促生长作用 ,以及应用吗啡后对此作用的影响。 方法 应用超滤器制备提取液、组织培养和 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳等技术 ,分离和检测神经营养活性物质。 结果 备用根大鼠手术侧脊髓后角提取液 >10 k D组分作用的 DRG神经突起的生长密度 ,比非手术侧 >10 k D组分 ,非手术侧 <10 k D组分和手术侧 <10 k D组分的生长密度明显增大。应用吗啡的备用根大鼠手术侧脊髓后角组织 >10 k D组分提取液作用的 DRG神经突起生长密度 ,又比备用根大鼠手术侧 >10 k D组分的大。经 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析发现 ,两组动物手术侧和非手术侧 >10 k D组分样品的电泳图谱区带数目大致相同 ,但两组动物手术侧分子量约 6 7k D、31k D和 16 k D的 3条区带吸收峰面积百分比 ,较非手术侧的高。 结论 吗啡具有进一步增强去传入纤维支配的脊髓后角组织 >10 k D组分提取液促进 DRG神经突起的生长效应。两组动物手术侧 >10 k D组分提取液分子量约 6 7k D、31k D和16 k D3种蛋白质含量有增高的趋势 ,尤其是吗啡组动物手术侧约 6 7k

备用根大鼠脊髓后角组织神经营养活性物质的分离纯化和生物活性测定

目的 进一步分离纯化备用根大鼠部分去传入纤维支配 (手术侧 )的脊髓后角组织提取液 ,以获得某种神经营养活性物质。 方法 用 Superdex G- 75 prep grade凝胶层析、高效液相色谱 (HPL C)层析和细胞培养等技术分离和检测神经营养活性物质。 结果 手术侧脊髓后角组织提取液经 Superdex G- 75 prep grade凝胶层析和 HPL C层析后 ,得到的 A峰洗脱液具有促进体外培养鸡胚背根节 (DRG)分离神经元存活及其神经突起生长的神经营养活性作用。经 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)显示 ,A峰洗脱液呈现一条分子量约为 6 0 k D的蛋白质主带。 结论 结合生物活性检测结果 ,分子量约 6 0 k

备用根大鼠脊髓后角组织提取液对培养的鸡胚背根节神经突起生长的影响

应用组织培养方法，观察备用根大鼠手术侧和非手术侧脊髓后角组织提取液对鸡胚背根节神经突起生长的影响。结果显示：备用根大鼠手术侧脊髓后角组织提取液作用的背根节神经突起生长密度（１５５．２５±１４．２５）明显高于非手术侧提取液作用的背根节神经突起生长密度（８９．１４±９．６０）。提示部份去传入纤维支配的脊髓后角组织可能存在着促进神经突起生长的神经营养活性物质。

部分去背根猫备用背根节和脊髓Ⅱ板层BDNF及其mRNA表达的变化

采用免疫组织化学和原位杂交技术探讨了部分去背根猫术后 3 d和 10 d的备用背根节和脊髓 II板层内 BDNF及其m RNA的表达变化。结果表明 ,正常组 ,BDNF主要分布于背根节的部分中、小神经元及脊髓背角浅层神经元内 ,II板层内还有大量的 BDNF阳性神经膨体。背根节同时也为 BDNF m RNA阳性 ,唯背角阴性。部分去背根后 10 d组 ,备用背根节 BDNF及其 m RNA阳性中、小神经元百分数较正常及 3 d者明显增加 (P<0 .0 5 )。而 L3,L5II板层 BDNF阳性神经膨体密度在术后两组均明显下降 (P<0 .0 5 ) ,唯 BDNF的含量在 3 d组者减少 (P<0 .0 5 ) ,10 d组者恢复 (P>0 .0 5 )。术后 II板层未见 BDNF m RNA的杂交信号。结果提示 :去背根术后 3 d组脊髓 II板层阳性膨体数的下降及 BDNF含量减少 ,可能是因背根切断导致输入脊髓 II板层的 BDNF中断所致 ;而 10 d时 II板层 BDNF合成得以恢复 ,可能来源于备用背根节中、小神经元的 BDNF增多所致 。

神经生长因子及trkA蛋白在部分去传入成鼠备用背根节中表达的研究

为探讨背根节中神经生长因子（ＮＧＦ）及ｔｒｋＡ蛋白对脊髓可塑性的作用，采用成年大鼠５只，建立单侧备用根模型（即切断一侧Ｌ１～４，Ｌ６～Ｓ１的脊髓节段背根，保留Ｌ５为备用根及备用背根节）。术后动物存活５天，灌流固定，取双侧Ｌ５背根节（ＤＲＧ）冰冻切片，用兔抗２．５ＳＮＧＦ及ｔｒｋＡ蛋白多克隆抗体分别进行Ｓ－Ｐ法免疫组化反应，ＤＡＢ显色。并对免疫反应阳性神经元进行图像分析。其结果手术侧ＤＲＧ中ＮＧＦ及ｔｒｋＡ蛋白阳性神经元的平均灰度值均分别显著小于非手术侧（Ｐ＜０．０１），表明手术侧阳性神经元中ＮＧＦ及ｔｒｋＡ的含量增加。结果提示。

针刺对备用DRG的NGF及其mRNA阳性大、中、小神经元数量的影响

本研究观察了 NGF及其 m RNA阳性神经元在 DRG大、中、小神经元中的数量变化 ,目的在于探讨 DRG各类神经元NGF变化与针刺促进脊髓可塑性的关系。对 5只成年猫进行双侧备用根手术。术后当日开始针刺一侧 L6 脊神经后肢分布区的两组穴位即足三里和悬中、伏兔和三阴交 ,每天一次 ,每次 3 0 min,连续针刺 7d后处死动物。取针刺侧与非针刺侧 L6 的 DRG制成 2 0μm厚冰冻纵切片。分别用 NGF抗血清和 NGF的 c RNA探针进行免疫组织化学反应及原位杂交染色。计数两侧 DRG相同面积内大 (>5 7μm)、中 (4 2～ 5 7μm)、小 (<42 μm)型 NGF及其 m RNA阳性神经元的数量。结果显示 :针刺侧备用 DRG NGF及其 m RNA阳性大、小型神经元的数量明显增加 (P<0 .0 5 ) ,而对中型神经元数量影响不明显。结论 :针刺促进脊髓可塑性可能与备用 DRG大、小神经元表达 NGF增多有关。

针刺对脊髓源性神经营养物质影响的探讨

本实验采用5只双侧备用根猫，一侧以电针刺激．术后5天取脊髓背角组织，用梯度电泳与细胞钓蛋白带技术寻找针刺后脊髓背角组织中促神经元存活的神经营养活性物质。结果显示，针刺侧Rf0．11带130KD的蛋白质量含量增加，促神经元存活效应增强．该活性蛋白可能与针刺促进备用根侧支出芽和突触重建有关。