DNA复制蛋白与复制体

有许多DNA复制蛋白是装配成一定的结构发挥作用,如引物体和复制体。在复制叉处,由DNA pol Ⅲ全酶二体、引物体和解螺旋酶装配成复制体,负责先行链和后行链的同时合成。复制中,后行链模板绕DNA pol Ⅲ全酶形成折迴环,随着复制体在复制叉处前移,后行链以5′→3′的方向合成冈崎片段。

与丙型肝炎病毒复制中间体3′末端结合的宿主蛋白的研究

宿主细胞蛋白在HCV复制过程中起着重要的作用 .应用蛋白质 核酸紫外交联法检测多个细胞株 ,目的是明确是否存在可与HCV复制中间体 3′末端特异性结合的细胞蛋白质 .结果显示 ,在多个细胞株中存在一个分子质量约为 45ku的蛋白质 (命名为 p45 ) ,可与HCV复制中间体 3′末端 131～ 2 78nt结合 ,这种结合可被过量的自身未标记RNA竞争抑制 ,而非同源蛋白和非同源RNA均不能竞争抑制这种结合 .根据计算机RNA二级结构分析推测 ,p45可能特异性结合于HCV复制中间体 3′端的一茎环结构内 .这一结果提示 ,p45在HCV子代RNA复制中可能起着重要作用 .

蓖麻蚕血细胞系的建立及同源核型多角体病毒的体外复制

蓖麻蚕血细胞系的建立及同源核型多角体病毒的体外复制沈中建陈梅琴吴祥甫（复旦大学生命科学学院病毒研究室，上海２００４３３）关键词蓖麻蚕，细胞系，核型多角体病毒，体外复制细胞培养技术已成为昆虫病毒基础和应用研究中极其有用的手段。尤其在人们利用杆状病毒作...

马传染性贫血病毒弱毒疫苗株跨膜蛋白截短突变对其体外复制特性影响

马传染性贫血病毒(EIAV)减毒疫苗是世界首例慢病毒疫苗,但其作用机理尚不明了.研究发现,EIAV疫苗株EIAVFDDV12的跨膜蛋白gp45在马体内发生高频率261W位点翻译终止突变,使该蛋白质C端出现154个氨基酸的截短.为了探讨该截短对EIAV疫苗株生物学特性的作用,以EIAV弱毒疫苗株感染性克隆为骨干,构建了gp45截短型感染性病毒株,检测该截短突变对EIAV疫苗株在体外培养的马外周血单核细胞由来的巨噬细胞(MDM)、驴MDM和驴胎皮细胞(FDD)中的复制.实验结果表明,gp45截短型毒株在马和驴MDM中复制能力比未截短型毒株显著降低(P<0.01),特别是在马MDM中此差异更明显.相反,截短型毒株在FDD中的复制能力则显著高于未截短型毒株(P<0.01).此外,结果显示gp45截短型毒株在马MDM中的低水平复制降低了EIAV对其靶细胞诱导的凋亡.以上结果提示,EIAV疫苗的gp45截短型毒株是适应在体外FDD细胞中传代致弱的变异,该变异导致疫苗株在EIAV体内主要靶细胞巨噬细胞中复制能力的降低,导致毒力进一步减弱.

芹菜夜蛾NPV离体复制的研究

芹菜夜蛾ＮＰＶ能够在小菜蛾细胞系中有效地复制增殖。受感染细胞呈典型细胞病理变化。病毒在细胞核中复制装配，病毒感染率为８５％，多角体产量为５８８×１０６ＰＩＢｓ／ｍｌ。病毒增殖动力学显示，病毒感染细胞７２ｈ，胞外病毒达最大滴度，ＴＣＩＤ５０值为１．９×１０８ＴＣＩＤ５０／ｍｌ。

ECRG2基因缺失通过p53途径导致中心体过度复制

目的探讨ECRG2基因调控中心体复制的分子机制。方法采用质谱法筛选ECRG2基因作用伙伴;采用免疫共沉淀法鉴定ECRG2与p53发生相互作用的位点;采用Western印迹法检测p53转录活性;采用免疫荧光技术观察ECRG2基因对p53中心体定位能力的影响。结果结果显示p53是ECRG2基因的一个新的作用伙伴。ECRG2基因通过其N端20个肽与p53发生相互作用,通过p53参与中心体复制。ECRG2基因缺失不但促进p53蛋白泛素化降解程度,降低p21蛋白活性,提高cyclinE/CDK2活性,从而启动了中心体过度复制,而且使p53蛋白无法定位于中心体,丧失了对中心体再复制的抑制作用。结论ECRG2基因通过p53参与中心体复制,一方面,ECRG2通过p53/p21/cyclin E/CDK2途径调控中心体复制;另一方面,ECRG2也可影响p53中心体定位能力,参与p53对中心体再复制的抑制作用。

ECRG2基因缺失导致HCT-116细胞中心体过度复制

目的:非整倍体是肿瘤细胞的典型特征,是人类肿瘤染色体不稳定性的普遍形式。中心体复制异常是肿瘤细胞中染色体不稳定性的主要原因。研究观察ECRG 2对中心体复制及染色体不稳定性的影响。方法:利用基因敲除和免疫荧光染色技术观察了ECRG 2基因对中心体复制和染色体不稳定性的影响。结果:s iRNA技术敲除ECRG 2基因导致中心体过度复制、多极纺锤体出现,最终导致染色体不稳定性和非整倍体细胞出现。结论:ECRG 2在中心体复制、纺锤体形成中起重要作用,对确保染色体稳定性必不可少;ECRG 2基因的缺失可能是肿瘤细胞染色体不稳定性和非整倍体细胞产生的重要原因。

油桐尺蠖核型多角体病毒在同源和异源细胞中复制效果的比较

自从昆虫细胞系建立以后,杆状病毒在体外系统中的复制一直是人们感兴趣的课题。油桐尺蠖核型多角体病毒(Bozura suppressaria Nuclear Polyhedrosis Virus,Bs一NPV)作为一种生物杀虫剂已成功地在茶园、杉木林中大面积使用,并已建立了对该病毒敏感的细胞系。多粒包埋型核多角体病毒(MNPV)在体外复制成功的报道较多。有的MNPV在体外感染的范围较宽,不仅能感染同源的细胞系,亦能感染异源的细胞系。单粒包埋型核多角体病毒(SNPV)在体外复制的报道较少,且大多数SNPV仅在同源细胞系内增殖。BsNPV是一种SNPV。本文用BsNPV接种1种同源细胞和3种异源鳞翅目细胞,比较BsNPV的感染和复制规律的异同。

樗蚕蛹精巢细胞系的建立及柞蚕NPV的体外复制

樗蚕蛹（philosamiacynthia）精巢细胞经2年多时间的离体培养，已传至100代以上，堪称无限细胞系，命名为PC－01。原代培养经4个月，开始传代。目前细胞系生长稳定，细胞形态多为圆形，少数为长椭圆形及梭形。细胞里悬浮生长，也有半贴壁现象。细胞群体倍增时间为72h，染色体数量变化较大。细胞系对柞蚕NPV非常敏感，经同工酶测试该细胞系的酯酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性较好。

鸭乙型肝炎病毒复制复合体（DHBV RCs）的提纯及其对外源模板的利用

鸭乙型肝炎病毒复制复合体（ＤＨＢＶＲＣｓ）的提纯及其对外源模板的利用邵兴无，陶佩珍，郭巨涛，陈鸿珊（中国医学科学院医药生物技术研究所，北京１０００５０）关键词鸭乙型肝炎病毒复制复合体，ＤＮＡ聚合酶，核心抗原，外源模板１鸭乙型肝炎病毒复制复合体（ＤＨＢ...

丙型肝炎病毒体外复制和表达的若干研究进展

近年来许多学者采用体外复制表达体系,建立HCV基因片段或全序列转染的细胞模型,研究HCV蛋白产物及其相互作用,且进一步研究病毒样颗粒的形成和细胞内定位,同时在体外敏感细胞的筛选和小动物模型建立等方面做了大量工作,为分析HCV生物学特性、致病机理、抗病毒治疗和疫苗研究等奠定了基础。本文就此及其进展予以综述。

棉铃虫质型多角体病毒 A B 两种类型体外复制特性的比较研究

分析比较了棉铃虫质型多角体病毒江苏株Ａ、Ｂ两种类型的离体复制特性。ＨａＣＰＶ－Ａ型（ＣＰＶ１４型）病毒可在多种昆虫细胞系中复制，而Ｂ型病毒只能在同源细胞系中增殖；Ａ型病毒的感染率和细胞内游离病毒粒子的滴度均高于Ｂ型病毒；感染细胞持续传代表明，ＨａＣＰＶ－Ａ型病毒感染的ＨＡ－８３１细胞在连续传代７次后，感染率从最初的１０．６％上升到８０％以上，反之，Ｂ型病毒感染的细胞，传代９次后已不能形成典型的多角体。同时，我们还率先成功地建立了ＣＰＶ的空斑测定技术，并初步尝试了混合型ＨａＣＰＶ的分离纯化。

HCV体外复制细胞模型的建立

目的建立HCV体外复制细胞模型。方法用含有生长HCV基因的p90/HCVFL-longpU质粒,转化Sure细胞,36℃摇菌18h,提取质粒,以线性化DNA为模板,用T7RNA体外转录系统作体外转录,转录产物RNA作RT-PCR、普通琼脂糖凝胶电泳鉴定。采用lipofectin包裹HCVRNA转染生长良好的HepG2细胞。转染48h后收集细胞,TRIzol提取RNA,分别用正链及负链引物作RT-PCR,确定转染细胞中有无HCV的复制中间体及病毒核酸。作免疫组化确定有无病毒NS3、NS5抗原。结果体外可获得高浓度全长HCV-RNA,但转染未获成功。结论全长HCV-RNA转染细胞模型的建立尚需进一步研究。

棉铃虫核型多角体病毒在同源和异源寄主细胞系内复制及其感染性比较

本文对棉铃虫核型多角体病毒(Heliothis armigera Nuclear Polyhedrosis Vi-rus,HaNPV)在3个同源寄主细胞(SIE-HAH-806、SIE-Ha-798及SIE-Ha-806)和3个异源寄主细胞(TN-368、SIE-MSH-805和IPLB-SF-21AEC)内的复制及其感染性进行了比较研究。从病毒在细胞内形成多角体的历程和感染细胞百分率、TCID50滴度、病毒在感染细胞中复制的电镜检查,以及子代病毒对棉铃虫幼虫的活体感染性试验都证实,HaNPV在异源寄主细胞内复制要优于同原细胞。讨论了核型多角体病毒离体复制时,有关的同源和异源寄主细胞问题。

颗粒体病毒离体复制

迄今 ,尚未建立稳定的颗粒体离体复制系统 ,颗粒体病毒在离体复制中的研究仍处于探索阶段。就颗粒体病毒离体复制的研究进展进行了综述 ,主要包括影响颗粒体病毒离体复制的细胞类型 ,培养温度以及颗粒体病毒离体复制的作用机理和目前仍存在的问题。

烟草丛顶病毒RNA依赖RNA聚合酶(RdRp)介导的体外复制体系

通过重叠PCR扩增得到烟草丛顶病毒(Tobacco bushy top virus,TBTV)中国分离物RdRp的编码序列,构建以pMALC2X为基础载体的原核表达载体pMAL-TB-RdRp。0.5 mM IPTG诱导可特异性表达分子量约为120 kDa的MBP-RdRp融合蛋白。温度梯度实验显示,18℃下诱导表达的MBP-RdRp融合蛋白的可溶性比例较高,约17%;经亲和层析纯化的MBPRdRp可特异性识别TBTV正链和负链的3'末端序列,催化体外复制;对正负链的3'末端的体外复制效率存在差别,识别负链3'末端的体外复制效率明显高于正链3'末端。本研究创建的TBTV RdRp介导的体外复制体系为进一步研究TBTV基因组复制调控奠定了基础。

复制酶体的瞻望和疑问

由若干酶组成的复合体参与双链DNA分子复制过程。这种活性蛋白质复合体称为复制酶体(replitase),而具有这些酶活性的蛋白质并不能独立起作用。这种复合体在DNA复制(S期)开始时才由其各种成分装配而成,而在细胞周期的Gl期则不复存在。在真核细胞的复制酶体中,参与dNTP生物合成的酶和参与DNA复制的蛋白质结合在一起。在此复合体被装配前,细胞内先合成了大量“粘合”蛋白,以便将这些有关的蛋白质粘合在一起。在真核细胞内是否有这样的复制酶体存在是多年来一个有争论的问题。作者认为真核细胞中的复制酶体可能由细胞核内、外的两个蛋白质复合体所组成,并由两者协同完成DNA复制。如果复制酶体的存在得到证实,将会对诸如细胞周期、DNA复制、癌症发生、抗癌化学疗法和抗代谢物的生物学作用等理论,产生相当大的影响。

肝细胞核因子4α增强型1.0倍HBV复制子体外复制模型建立及初步应用

目的建立一种肝细胞核因子4α（HNF4α）增强型1.0倍HBV复制子体外复制模型。方法从临床获得的急性乙型肝炎患者血清中扩增并克隆HBV全长DNA;手术获得肝组织中提取总RNA,扩增并克隆HNF4α基因cDNA。BspQI/ScaI双酶切回收HBV全长DNA,HNF4α基因cDNA定向连接到真核表达载体pcDNA3.1（＋）中,构建pcDNA3.1-4α表达载体。将HBV全长DNA1μg/孔,按比例共转染pcDNA3.1-4α（0,0.5μg,1μg）于HepG2细胞,96 h后检测细胞上清中的HBsAg、HBeAg和HBV DNA;以0.5μg/1μg pcDNA3.1-4α与HBV全长DNA共转染HepG2细胞,加入不同浓度LAM（0,100μmol/L）和ETV（0,10μmol/L）,评价建立的体外复制模型。结果 1%TAE琼脂糖凝胶电泳鉴定HBV全长DNA和HNF4αcDNA PCR产物,条带长度为3.2 kb和1.5 kb;目的片段克隆后测序鉴定正确。胶回收HBV全长DNA克隆质粒酶切目的片段,构建的pcDNA3.1-4α表达载体酶切鉴定正确后,测序鉴定。不同浓度比例的pcDNA3.1-4α与HBV全长DNA转染HepG2细胞后,0μg/1μg组合：HBeAg阴性,HBsAg阴性,上清HBV DNA载量为103;0.5μg/1μg组合：HBeAg阴性,HBsAg A值从0.1升高到1.99,上清HBV DNA载量从1×10^3 IU/mL升高到4×10^4 IU/mL;1μg/1μg组合：HBeAg阴性,HBsAg A值从0.1升高到2.4,上清HBV DNA载量从1×10^3 IU/mL升高到1×10~5 IU/mL;LAM从0~100μmol/L,细胞上清HBV DNA降低了97.6%;ETV从0~10μmol/L,上清HBV DNA降低了99.0%。结论 HNF4α增强型1.0倍HBV复制子体外复制模型,可以体外评价临床常用抗病毒药物,为后续HBV研究提供新思路。

口蹄疫病毒复制复合体的研究进展

口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV)是小RNA病毒科口蹄疫病毒属的成员,属单股正链RNA病毒。FMDV感染宿主细胞后会重塑宿主的内膜系统,改变宿主细胞内膜环境,形成复制复合体(Replication Complex)。该复制复合体为囊泡状结构,是由FMDV的非结构蛋白和某些宿主细胞因子共同调控产生的病毒“复制工厂”,为FMDV提供稳定的微环境,使得病毒的翻译、转录、复制、病毒粒子的包装得以高效有序的进行,帮助病毒逃脱宿主的免疫反应,对病毒扩增基因组和产生有传染性的子代病毒至关重要。本文将介绍FMDV复制复合体的结构、功能以及主要成分的生物学意义,为深入研究口蹄疫病毒的复制复合体和探索更有效的防治措施提供参考。