非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫对雏鸡组织荷虫量及脾脏细胞因子表达水平的影响

将2周龄雏鸡随机分成3组,试验组雏鸡颈部皮下注射0.l mL 107个/mL非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫(NRTUAs),感染对照组和空白对照组分别注射等剂量的RH虫株和PBS;于感染的第4天采集各组雏鸡的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、睾丸、法氏囊、胸腺、脑、胸肌、腿肌组织,提取其DNA,采用绝对荧光定量PCR检测各器官组织的荷虫量;提取剩余脾脏组织的RNA,采用相对荧光定量PCR仪检测脾脏中IL-1β、IL-6、TNF-α、CCL26、STAT1、IRF1、IFN-γ、IL-10的转录水平。结果表明,雏鸡感染弓形虫的第4天,各器官组织不能完全清除NRTUAs,除肝脏、睾丸、腿肌和脑组织外,NRTUAs组的组织荷虫量均显著低于RH组的;NRTUAs刺激脾脏不会使免疫相关细胞因子的转录水平显著上调或下调,说明NRTUAs是致病性较低的虫株,不会刺激雏鸡脾脏引发强烈的先天性免疫反应,不会引起促炎、抑炎因子的过量产生。

非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫刺激雏鸡脾脏的转录组学分析

【目的】探究非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫(NRTUAs)感染雏鸡脾脏的转录组学变化,明确NRTUAs对雏鸡脾脏先天性免疫的调节效果,为研发家禽抗弓形虫疫苗提供理论依据。【方法】分别以NRTUAs和磷酸盐缓冲液(PBS)感染14日龄雏鸡,感染后第3 d采集脾脏组织样品进行转录组测序,筛选出NRTUAs组与PBS组间的差异表达基因(DEGs),然后进行GO功能注释、KEGG信号通路富集及蛋白调控网络分析,并通过实时荧光定量PCR验证转录组测序的准确性。【结果】与PBS组相比,从感染NRTUAs的雏鸡脾脏中筛选出499个DEGs(286个为上调DEGs,213个为下调DEGs),且NRTUAs组中上调表达的DEGs多于下调表达的DEGs。GO功能注释分析发现,DEGs注释在生物过程(Biological process,BP)、细胞组分(Cellular component,CC)和分子功能(Molecular function,MF)三大类别的58个功能条目上,主要涉及端粒蛋白定位建立正调控、蛋白稳定、含伴侣蛋白T-复合物、内质网腔、内质网、内质网膜组成部分、纺锤中央区及未折叠蛋白结合等功能条目;KEGG信号通路富集分析显示,DEGs主要富集在内质网蛋白加工通路、RNA转运、细胞周期、钙信号通路、黏着斑、细胞衰老、神经活性配体—受体相互作用、细胞因子—细胞因子受体相互作用通路及氨基酸生物合成等通路中;蛋白互作网络分析结果表明,DEGs编码蛋白PLK1、CCNB1、CDK1、CDC20、CCNA2和NDC1均在细胞周期通路上调表达。实时荧光定量PCR验证结果显示,只有2个DEGs(CXCL12和VPREB3)呈上调表达,其余8个DEGs呈下调表达,与转录组测序结果基本一致。【结论】感染NRTUAs后雏鸡脾脏免疫相关基因表达上调,且多数DEGs富集在内质网蛋白合成与细胞周期等相关信号通路上,脾脏细胞活动明显增强,即通过加快建立细胞连接及启动先天性免疫反应而积极对抗弓形虫入侵。

HIV-1复制型DNA疫苗与非复制型重组痘苗病毒疫苗在小鼠体内细胞免疫效果的研究

目的:用HIV-1复制型DNA疫苗和非复制型重组痘苗病毒疫苗(rNTV-C)进行单独免疫和联合免疫的研究(2种疫苗分别包含HIV-1 B'/C亚型的gp160、gag-pol、rev-tat-nef等6种基因),以了解这2种新型HIV疫苗单独免疫及联合免疫的效果,并为临床免疫方案的制定提供实验依据。方法:将HIV-1 DNA疫苗和rNTV-C疫苗免疫BALB/c小鼠,设计rNTV-C单独免疫组、DNA单独免疫组,以及DNA初免、rNTV-C加强的联合免疫组,并设计不同免疫途径和不同剂量的各种组合。用IFN-γELISPOT检测各组的细胞免疫效果,用统计学方法分析比较各组细胞免疫效果的差异。结果:DNA疫苗和rNTV-C疫苗单独免疫时,二者都能诱发针对各抗原的特异性免疫反应;联合免疫能够诱发比DNA或rNTV-C单独免疫都强的特异性细胞免疫反应。统计分析显示,2种疫苗采用肌肉注射途径的免疫效果显著高于皮内注射,1μg和5μg DNA疫苗的免疫效果差异不显著,而1×108 PFU的rNTV-C比2×107PFU的免疫效果要强。结论:联合免疫策略能够显著增强HIV-1疫苗各抗原的免疫原性,通过对2种HIV-1疫苗单独免疫及二者联合免疫的细胞免疫反应的分析比较,确定了较好的免疫方案,为疫苗临床前免疫效果评价和临床方案的制定提供了实验依据。

表达EB病毒主要膜蛋白gp350/220的非复制型重组痘苗病毒的构建

利用非复制痘苗病毒质粒载体 pNEOCK11β75及 pNEOCK ,改造了表达EB病毒主要膜蛋白 gp35 0 /2 2 0的复制型重组痘苗病毒VMA ,构建了非复制型重组痘苗病毒VMAΔCK。该病毒能在鸡胚原代成纤维细胞 (CEF)中正常繁殖 ,而在人源细胞中不能正常繁殖。在CEF中连续传代至第 2 5代 ,经PCR证明 ,该病毒符合非复制型重组痘苗病毒的特征。经免疫荧光及免疫酶斑法证实 ,VMAΔCK可稳定表达gp35 0 /2 2 0 ,且表达水平与VMA无明显差异。VMAΔCK经腹腔免疫Balb/C小鼠 ,4周后能诱生一定水平的抗 gp35 0 /2 2 0特异性抗体 ,加强免疫 2周后该抗体水平明显升高。这一结果类似于VMA免疫Balb/C小鼠的结果。初免后 ,VMAΔCK免疫组抗痘苗抗体水平明显低于VMA免疫组 ;加强免疫 2周后 ,两组小鼠的抗痘苗抗体水平趋于一致。上述结果证明 ,所构建的非复制痘苗病毒不影响目的抗原的表达 ,也不影响该抗原的免疫原性 ,但导致病毒毒力下降 ,而且用该病毒免疫小鼠后小鼠抗痘苗病毒载体的免疫反应明显下降。

表达流行性感冒病毒HA基因非复制型重组腺病毒的构建及免疫效果的研究

通过RT PCR扩增流行性感冒(流感)病毒HA基因,克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack CMV,该重组质粒与腺病毒DNA共转化E.coliBJ5183,通过细菌内同源重组获得重组腺病毒DNA,将其转染293细胞获得重组腺病毒。PCR证实HA基因已整合至腺病毒基因组中,Westernblot结果检测到重组病毒感染293细胞中HA的表达。重组病毒经滴鼻和灌胃两种途径免疫小鼠,结果2次免疫后滴鼻组和灌胃组均产生明显的免疫应答,血清IgG抗体滴度分别为1∶10000和1∶1000。除血清IgG外,还在肺灌洗液中检测到分泌型IgA。滴鼻组的免疫效果强于灌胃组。经小剂量攻毒实验显示,重组腺病毒保护率为100%。该文成功构建了表达流感病毒HA基因的非复制型重组腺病毒,重组病毒免疫小鼠可产生较好的免疫效果。

携带TRAIL基因的条件复制型腺病毒载体的构建及其辐射诱导表达

目的:构建携带早期生长反应基因-1(Egr-1)启动子和肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)基因的条件复制型腺病毒载体pAd-Egr1-TRAIL-hTERT-E1A-E1Bp-E1B55K,观察其联合2.0Gy X射线照射对人乳腺癌MDA-MB-231细胞TRAIL表达的影响。方法:以pMD18T-Egr1为模板,成功克隆Egr-1序列,将TRAIL基因置于下游,构建条件复制型腺病毒载体pShuttle-Egr1-TRAIL-hTERT-E1A-E1BpE1B55K(CRAd.pEgr1-TRAIL),病毒包装后感染细胞,给予X线照射,利用Real time PCR法检测TRAIL mRNA表达水平,ELISA法检测TRAIL蛋白表达水平。实验设对照(control)组、2Gy组、空病毒(CRAd.p)组、CRAd.p+2Gy组、CRAd.p-Egr1-TRAIL组和CRAd.p-Egr1-TRAIL+2Gy组。结果:成功构建pAd-Egr1-TRAIL-hTERT-E1A-E1Bp-E1B55K,并进行了病毒包装。以病毒滴度5感染复数(MOI)感染MDA-MB-231细胞24h后给予2.0Gy X射线照射,4h后MDA-MB-231各组细胞中TRAIL mRNA表达水平开始升高,8h后各组表达达峰值;CRAd.pEgr1-TRAIL+2.0Gy组mRNA表达水平升高最为明显,约为对照组的160倍(P<0.01),随后表达水平逐渐下降;6h后各组MDA-MB-231细胞中TRAIL蛋白表达水平开始升高,24h后各组TRAIL蛋白表达水平达峰值,48h后TRAIL蛋白表达水平下降,但仍未降至正常水平;与其他各组比较,CRAd.pEgr1-TRAIL+2.0Gy组TRAIL蛋白表达水平升高最明显(P<0.01)。结论:成功获得条件复制型腺病毒载体,联合2.0Gy X射线照射可使MDA-MB-231细胞中TRAIL mRNA和蛋白表达水平升高。

表达PEDV中国变异株S蛋白复制型重组人腺病毒4型的构建及其免疫原性研究

为构建表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白复制型重组人腺病毒4型(HAdV-4)及评价其免疫原性,本研究利用RT-PCR扩增得到PEDV中国变异株纤突(S)基因的N-末端区域(1 bp^1 140 bp),构建重组质粒p Ad4FAST-Shuttle-S,重组质粒经线性化和同源重组,得到含有PEDV S基因的重组HAdV-4感染性克隆,纯化的感染性克隆DNA经PacⅠ线性化后转染HEK293细胞,拯救得到表达PEDV变异株S蛋白的重组病毒rAd4△E3-S。将该重组病毒免疫小鼠,间接ELISA测定其血清中抗S蛋白抗体水平,利用体外淋巴细胞转化试验和流式细胞技术检测免疫小鼠T淋巴细胞反应。结果显示,重组病毒能够表达PEDV S蛋白,并且能刺激小鼠产生特异性体液和细胞免疫应答。本实验结果为进一步研究重组病毒在猪体上的免疫反应奠定基础,也为PEDV活载体疫苗的研发提供实验依据。

以非复制型HIV为载体进行目的基因转移的实验研究

目的探讨非复制型HIV作为基因转移载体的有效性,为卵巢癌基因治疗转移方法提供新思路。方法磷酸钙沉淀法将非复制型HIV基因转移载体(pHR'CS)系统中的3种成分质粒共转染入病毒包装细胞293T,荧光显微镜、电镜、荧光分光光度计检测病毒产生情况。病毒上清过滤、浓缩后感染卵巢癌细胞SKOV3和正常人成纤维细胞GF,荧光显微镜下观察感染效果。PCR、RT-PCR鉴定目的基因HSV-tk在靶细胞中的整合转录结果。光镜观察及MTT法测定GCV的体外杀伤效应,计算细胞生长抑制率(GIR)和半数抑制浓度(IC50)。结果荧光显微镜下观察到293T细胞中有大量GFP表达,透射电镜下观察到大量浓缩后病毒颗粒,荧光分光光度计检测到510nm处有一高吸收峰,此非复制型HIV感染卵巢癌细胞SKOV3和正常人成纤维细胞GF后,PCR、RT-PCR均显示600bp的HSV-tk阳性条带。光镜观察到细胞在GCV作用后出现明显形态变化;MTT法显示GCV对转导HSV-tk的SKOV3和GF细胞有显著杀伤作用。结论非复制型HIV可将目的基因高效转移至卵巢癌细胞中,为一种有效的基因转移载体。

单重靶向条件复制型腺病毒穿梭载体pshuttle-E1A-E1Bp-E1B55K的构建及鉴定

目的:构建并鉴定一种新型E1A基因CR2区选择性缺失的腺病毒穿梭载体pshuttle-E1A-E1Bp-E1B55K,为包装单重靶向条件复制型腺病毒进行肿瘤基因治疗奠定基础。方法:采用RT-PCR法从人胚肾细胞(293T)中扩增条件复制型腺病毒必需的E1区基因,包括E1A、E1Bp及E1B55K基因片段;重叠PCR法扩增CR2区缺失的E1A基因;采用基因重组技术构建pshuttle-E1A-E1Bp-E1B55K重组质粒,并进行PCR及酶切鉴定。结果:经测序证实获得的E1B55K及CR2区缺失的E1A基因与GenBank公布的完全一致,E1A基因CR2区缺失的pshuttle-E1A-E1Bp-E1B55K质粒经分别经XbaⅠ与KpnⅠ单酶切,得到大小约为817和1244bp的酶切片段,PCR鉴定得到约250及1148bp的基因片段,鉴定结果与预期结果完全一致。结论:E1A基因CR2区选择性缺失的单重靶向条件复制型腺穿梭载体pshuttle-E1A-E1Bp-E1B55K构建成功。

双重靶向条件复制型腺病毒的包装及抗肿瘤作用

目的构建并包装以人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)启动子调控E1A(CR2区缺失)蛋白表达的肿瘤细胞双重靶向条件复制型腺病毒(conditionally replicating adenovirus,CRAd),并探讨其对肿瘤细胞的抑制作用。方法采用PCR技术扩增hTERT启动子序列,将其克隆至pShuttle-E1A-E1Bp-E1B55K载体(E1A基因CR2区缺失)中,构建重组腺病毒质粒,并转染HEK293细胞进行病毒包装,PCR鉴定;CCK-8法检测重组腺病毒(CRAd.p-hTERT-E1A-E1Bp-E1B55K,简称CRAd.p)对肿瘤细胞的抑制作用。结果 hTERT启动子序列克隆正确;pShuttle-hTERT-E1A-E1Bp-E1B55K经KpnⅠ单酶切可见1 542bp和6 775bp两条电泳带,PCR鉴定得到250、1 148bp和298bp基因片段;CRAd.p经PCR扩增得到250、1 148bp和298bp基因片段,鉴定结果与预期完全相符;CRAd.p感染MCF-7、MDA-MB-231、HepG2和HTC-8细胞72h后与各自对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01);CRAd.p感染MDA-MB-231细胞后10～250MOI组细胞吸光度值与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01),随着感染时间延长,抑制作用越发明显。结论成功获得对肿瘤细胞具有双重靶向和溶瘤作用的条件复制型腺病毒,为基因治疗的靶向性和有效性提供了可能。

细菌内同源重组法构建HBV S区和C区基因非复制型腺病毒载体及其体外表达

目的:构建表达乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)的非复制型重组腺病毒载体,并检测他能否在真核细胞中有效表达目的基因。方法:扩增乙肝病毒(HBV)前S_2/S基因和前C/C基因片段,分别亚克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,与5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共转染BJ5183细菌,经细菌内同源重组产生分别携带HBV S区和C区基因的重组腺病毒载体pAd-HBs和pAd-HBe,经脂质体法转化293细胞包装产生重组腺病毒Ad-HBs和Ad-HBe体,外转染293和Vero细胞,RT-PCR和ELISA法检测目的基因的表达。结果:构建了表达HBsAg和HBeAg基因的重组腺病毒,病毒滴度可达5×10^(12)pfu/L,并能在真核细胞中有效表达目的基因。结论:成功构建表达HBsAg和HBeAg的重组腺病毒载体,为进一步开展HBV基因治疗研究提供实验基础。

表达乙型肝炎病毒表面抗原的非复制型重组痘苗病毒疫苗株RVJ123ΔCK的构建及其生物学性状鉴定

利用重组质粒 pNeo-CK与 pNeo-CKLacZ和表达乙型肝炎 (乙肝 )病毒S抗原的重组痘苗病毒RVJ12 3[1] ,构建了非复制型重组痘苗病毒RVJ12 3ΔCK。Southernblot证实 ,非复制型重组病毒RVJ12 3ΔCK基因组C和K片段间与宿主范围和毒力相关的基因稳定缺失 ,同时 ,J片段中插入的乙肝S抗原基因稳定存在。重组病毒RVJ12 3ΔCK在鸡胚成纤维母细胞中可良好繁殖 ,而在人源细胞系中不繁殖或仅低度繁殖 ,但都能表达HBsAg ,并且在病毒一个复制周期内 ,复制型和非复制型病毒HBsAg表达水平无明显差别。

复制型重组痘苗活载体疫苗生产工艺研究

目的研究复制型重组痘苗活载体疫苗的生产工艺。方法通过在病毒-细胞比(MOI)、不同培养时间、培养温度、碳酸氢钠含量的条件下培养复制型重组痘苗病毒,确定适用于重组痘苗活载体疫苗的生产工艺。以确定的生产工艺制备3批疫苗,并进行各项检定。结果以MOI为1∶750,培养液中加入7.5%碳酸氢钠的比例为1.0%,培养温度为37℃,培养时间为72 h左右,获得疫苗的病毒滴度最高。按此生产工艺生产的3批疫苗,病毒滴度均在107PFU/ml以上,经检定各项指标均合格。结论确定了复制型重组痘苗活载体疫苗的生产工艺。

CAR-T细胞治疗产品中复制型病毒的风险分析及控制

嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)因其在血液肿瘤中的显著疗效已成为肿瘤免疫治疗领域中的国际研究新热点,成为肿瘤治愈新的希望。目前,在CAR-T细胞产品的生产中,通常是利用逆转录病毒载体或慢病毒载体将CAR基因高效地导入T细胞中,但在使用这些病毒载体的同时也带来了CAR-T产品污染复制型逆转录病毒(RCR)或复制型慢病毒(RCL)的潜在风险。虽然随着病毒载体设计及生产体系的不断改进,这种风险已大大降低,但仍不能完全排除。因此,监管机构要求对于临床使用的慢病毒或逆转录病毒载体、转导的CAR-T细胞产品以及患者均要进行复制型病毒的检测。本文主要通过分析复制型病毒污染检测的必要性、降低复制型病毒污染风险的措施、复制型病毒检测的阶段以及检测方法等方面,提出在CAR-T细胞生产过程中控制RCR/RCL的策略,以供CAR-T细胞产品研发者参考。

表达乙型脑炎病毒抗原的非复制型重组痘苗病毒能在小鼠中诱发免疫保护

使用2×107PFU乙脑病毒野毒株GSS抗原preM-E-NS1-NS2a的非复制型重组痘苗病毒NTV-JEV免疫3周龄BALB/c小鼠,小鼠体内乙脑病毒特异性抗体滴度1∶71,IgG2a/IgG1为1.5,中和抗体滴度为1∶8,免疫组小鼠产生特异性补体介导的细胞杀伤作用。以10 LD50乙脑P3株病毒对小鼠进行了脑内攻击,NTV-JEV免疫组小鼠存活率为100%,与乙脑减毒活疫苗SA14-14-2免疫组存活率相同。100 LD50P3株病毒攻击后NTV-JEV免疫组存活率28.6%,与SA14-14-2组免疫效果无明显差别。存活小鼠体内乙脑病毒特异性抗体升高为1∶179,IgG2a/IgG1比值为1.9,中和抗体大于1∶16。以30 LD50GSS株病毒进行攻击后,NTV-JEV免疫组和SA14-14-2组保护率均为8.3%。上述结果表明,NTV-JEV与乙脑减毒活疫苗SA14-14-2株具有相近的保护力,NTV-JEV不仅可以保护小鼠抵抗同株病毒GSS的攻击,而且可以抵抗异株病毒P3的攻击。

表达人乳头瘤病毒58型L1、L2壳蛋白的非复制型重组痘苗病毒疫苗株的构建

采用PCR定点突变方法 ,对HPV5 81L1基因中痘苗病毒早期基因转录终止信号TTTTTNT结构进行修饰 ,并保留氨基酸不变。选用非复制型重组痘苗病毒为载体 ,将修饰的L1基因 1 5kb和L2基因 1 4kb分别插入痘苗病毒表达载体 pJSD的 7 5k和H6早期启动子之后 ,使之与非复制型重组痘苗病毒在TK区重组。经单斑筛选纯化 ,获得共表达HPV5 8L1、L2晚期蛋白的非复制型重组痘苗病毒疫苗实验株。该病毒在CEF细胞上连续传至第15代 ,经斑点杂交分析 ,重组痘苗病毒基因组中有L1和L2基因插入 ;经Westernblot检测 ,重组病毒能稳定表达HPV5 81L1及L2蛋白。此结果为HPV5

表达HPV16E6和E7蛋白的非复制型重组痘苗病毒的构建

为研制HPV16的治疗性疫苗 ,首先将表达质粒 pJSA1175与非复制型痘苗病毒NTVJTK+ 进行同源重组 ,构建了痘苗重组病毒NTVJLac。再将表达质粒 pJSDME6E7R与NTVJLac进行同源重组 ,构建了表达HPV16E6和E7蛋白的非复制型重组痘苗病毒NTVJmE6E7,并对获得的重组病毒进行了鉴定。Southern杂交显示 ,重组痘苗病毒NTVJmE6E7基因组中有E6和E7基因插入。该重组病毒在人源细胞中不复制。Westernblot显示 ,重组病毒在人源TK-14 3细胞中能表达E6和E7蛋白。

两种不同AFP启动子控制下表达HIV vpr基因的重组非复制型腺病毒获得及鉴定

目的 构建及包装由全长 5 1kbAFP启动子和低氧反应元件 (HRE)与 0 3kbAFP启动子两者组合的杂合0 3kbAFP启动子控制下表达HIVvpr基因的两种重组非复制型腺病毒。方法 采用细菌内同源重组腺病毒载体制备方法和PacI酶切、PCR、SouthernBlot鉴定方法。结果 构建及包装出由这两种AFP启动子控制下表达HIVvpr基因的重组非复制型腺病毒 ,经PacI酶切、PCR和SouthernBlot基因整合分析证明构建成功。结论 我们成功构建了的全长5 1kbAFP启动子和HRE与 0 3kbAFP启动子两者组合的杂合 0 3kbAFP启动子控制下表达HIVvpr基因的重组非复制型腺病毒 。

双表达狂犬病毒基因的非复制型痘苗病毒改建及免疫效果

为减少重组病毒非必需外源基因,进一步提高非复制重组痘苗病毒狂犬病疫苗的安全性,本研究改建不含报道基因LacZ的双表达狂犬病毒aG株G、N的非复制重组痘苗病毒VTKRGΔCKRN。采用G418-neo富集、蓝白斑及免疫蚀斑筛选等方法,以表达狂犬病毒糖蛋白(RG)基因的非复制重组痘苗病毒VTKRG△CKlacZ作为亲本株,利用同源重组原理,删除C与K片断间lacZ,并将狂犬病毒核蛋白(RN)基因插入C-K片段间。经核酸及蛋白水平检测表明VTKRGΔCKRN能同时稳定有效地表达狂犬病毒G和N,并具有非复制病毒生长特性。重组病毒裸鼠毒力实验表明VTKRG△CKRN较复制型重组痘苗病毒VTKRG病毒毒力显著减弱。VTKRGΔCKRN免疫小鼠可诱生较高有效中和抗体,并能保护小鼠免于致死剂量狂犬病毒攻击。以1.6×106PFU较低免疫剂量、仅一次免疫狗可保护狗经致死量中国狂犬病毒街毒株SBD株攻击后存活,诱生具有保护性中和抗体。非复制狂犬-痘苗重组病毒VTKRGΔCKRN免疫效果好、更具安全性。

Q-PCR法检测腺病毒基因治疗产品中的复制型腺病毒

目的:建立Q-PCR法检测腺病毒基因治疗产品中的复制型腺病毒(RCA)。方法:首先制备高纯度的pXC1质粒参考品(含有E1基因序列),紫外吸收法定量后经过数学换算得到拷贝数;然后比较染料法和探针法的灵敏度,建立适用的Q-PCR检测方法;最后用新建Q-PCR法定量测定腺病毒基因治疗产品中的RCA。结果:pXC1质粒参考品的拷贝数初步标定为2.6×1010拷贝/μL;探针法的灵敏度比染料法高1000倍;将pXC1质粒参考品应用于Q-PCR(探针法)测定腺病毒基因治疗产品中的RCA,标准曲线回归方程为y=-1.416ln(x)+47.395,R^2=0.9966,供试品的Cq值均位于标准曲线范围内。结论:新建Q-PCR法适用于检测腺病毒基因治疗产品中的RCA,且结果准确可靠。