首次成功克隆流感病毒复制基因

对流感病毒体内具有复制功能的蛋白质RNA聚合酶基因的克隆，日前获得成功。对于流感病毒遗传基因的亚克隆，并绘制出该基因的图谱这在世界上尚属首次。

哈尔滨首次成功克隆流感病毒复制基因

哈尔滨医科大学对流感病毒体内具有复制功能的蛋白质RNA聚合酶基因的克隆，日前获得成功。

普通烟草GRAS基因家族鉴定及表达模式分析

GRAS转录因子是植物中特有的转录因子,在植物的生长发育、信号转导、生物和非生物胁迫响应中均起着重要作用。本研究利用生物信息学手段从普通烟草基因组中鉴定得到了95个烟草GRAS基因,其中有50个GRAS家族成员不均匀地分布在20条染色体上。从系统进化、共线性和表达模式等方面对烟草GRAS基因家族成员进行了深入分析。结果表明,烟草GRAS基因可划分为8个亚家族,共有26个烟草GRAS成员源自全基因组复制事件,与拟南芥GRAS基因之间预测到16个共线性基因对。GRAS基因家族成员的表达具有一定的组织特异性,其启动子含有多个与生长发育、信号转导和胁迫相关的顺式作用元件,且部分成员响应盐和干旱胁迫,暗示其可能参与烟草胁迫响应等信号传导过程。本研究将为深入研究烟草GRAS家族基因的生物学功能奠定理论基础。

胡麻P5CS基因家族进化模式分析及LusP5CS1基因耐旱能力验证

吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)是植物中由P5CS基因编码的一种与干旱胁迫响应紧密联系的关键酶,它主要负责调节脯氨酸的生物合成。研究胡麻P5CS基因家族进化模式对进一步探索其在胡麻耐旱过程中的作用机制具有重要意义。本研究以拟南芥的2个P5CS基因作为查询序列,从胡麻、油菜、大豆、花生、向日葵、水稻、小麦等主要粮油作物的基因组中筛选获得P5CS基因家族成员。并通过分析不同作物P5CS基因受选择压力的大小、位点及功能分化潜力等阐明其进化模式,并在拟南芥中对其进行功能验证。研究结果显示,与其他作物的同源基因相比,胡麻P5CS基因家族成员在基因结构和进化模式上存在显著差异。在拟南芥中过表达受正向选择的胡麻LusP5CS1基因可以显著增加转基因拟南芥脯氨酸的积累并增强其耐旱性;在非干旱胁迫下过表达转基因拟南芥也表现出明显的适合度优势。本研究为胡麻耐旱分子机制和抗旱育种提供了理论基础。

4种作物果糖激酶基因的鉴定与比较分析

【目的】基于全基因组序列,鉴定与分析水稻、玉米、高粱和谷子4种作物的果糖激酶(fructokinase, FRK)家族基因,明确其复制起源方式、系统发生关系、序列及表达分化特征等,为深入开展FRK基因功能研究、改良作物产量和品质等提供数据。【方法】采用基因组搜索、基因组内及组间比较等多种方法,分析4种作物FRK家族成员的基因结构、保守基序、系统进化、复制扩张和基因表达分化等。【结果】鉴定到水稻13个、玉米16个、高粱14个、谷子16个FRK基因家族成员,其中水稻11个、玉米7个、高粱12个、谷子13个基因为离散复制基因,水稻、高粱和谷子各有1对ρWGD基因,玉米有8个WGD基因(1个ρWGD基因,7个mWGD基因)。该家族成员亚家族间基因结构差异大,但在亚家族内具有保守性。基因表达模式分析发现,直系同源基因间的表达模式相似,ρWGD基因对发生了明显的表达分化,而玉米物种特异的mWGD基因对的表达差异较小。【结论】探明了4种作物基因组包含的FRK家族基因,揭示了其复制起源、基因结构、序列及表达模式的演化特征。

基因枪介导法向小麦导入黄花叶病毒复制酶基因的研究

筛选出适宜小麦转化的优良基因型扬麦 15 8和扬麦 10号。以扬麦 15 8幼胚愈伤组织为受体 ,利用基因枪介导法将含有小麦黄花叶病毒复制酶基因 (WYMV- N ib8)的 pubi Nib8质粒转入了小麦。T0 代经 PCR扩增分析 ,获得了 14株含 WYMV- N ib8基因的转化植株 ,转化率为 0 .4 3%。T1、T2 代跟踪分子检测和 T2 代田间病毒抗性鉴定结果表明 ,获得了 4个抗

病毒复制酶基因Nib8和ERF转录因子W17基因枪法共转化小麦

将对小麦黄花叶病毒表现高抗的复制酶基因Nib8和具有广谱抗病性的ERF基因W17分别构建到单子叶高效组成型表达载体上,采用基因枪共转化法转化到小麦品种扬麦12和扬麦16中,PCR检测共获得Nib8基因的阳性转基因植株42株,W17基因的阳性转基因植株48株,及两个功能基因均为阳性的转基因植株6株。以扬麦12为受体的转化率分别为1.53%(Nib8)、4.87%(W17)和0.42%(Nib8+W17);以扬麦16为受体的转化率分别为2.05%(Nib8)、0.86%(W17)和0.20%(Nib8+W17)。对2个功能基因都呈阳性的6个植株进行Southern blotting分析,进一步证实功能基因已经整合到小麦基因组中。本研究为获得具有综合抗病性的小麦新材料奠定了基础。

改造的马铃薯Y病毒复制酶基因介导高度抗病性

提取马铃薯Y病毒中国分离株(PVY-C)的mRNA作为模板,随机六聚脱氧核苷酸和寡聚dT为引物合成了单链cDNA。通过聚合酶链式反应(PCR)获得了PVY-C的核内含体b(NIb)全长cDNA克隆。在对其进行全序列分析的基础上,构建了PVY-C NIb基因全长,5＇端缺失381个碱基和NIb反义RNA三种不同形式高等植物表达载体。在土壤农杆菌LBA4404的介导下,转化烟草生产品种NC89,获得了所有三种表达载体的转基因植株。通过分子生物学检测和抗性分析发现不同形式的NIb基因序列的转基因植株对马铃薯Y病毒表现不同程度的抗性。其中,以5＇端缺失的NIb的基因转化植株表现最好,从总共20个这类转化株系中筛选到4个株系至少在100μg/ml PVY-C接种浓度下,表现完全的抗病效果。从总共39个全长NIb基因转化株系中,仅有一个株系,在100μg/ml PVY-C的攻毒接种下具有完全的抗病性。所有33个NIb基因反义RNA的转化植株中,无一株系表现完全的抗病效果,但是有部分株系能不同程度地延缓或减轻发病程度,并有部分植株在发病后50d左右有恢复健康的趋势。虽然能够在上述3种形式的NIb基因序列的转基因植物中检测到相应的RNA的转录产物,但是均未能检测到其相应的蛋白表达产物。

马铃薯Y病毒复制酶基因植物表达载体构建及转基因烟草的培育

用ＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ从重组克隆ｐＺＤ－１中切下马铃薯Ｙ病毒脉坏死株系复制酶基因，将其插入质粒ｐＲＯＫ２相应切点中构成植物表达载体．用重组ｐＲＯＫ２转化农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４菌株，通过重组农杆菌侵染叶盘将复制酶基因转入烟草品种ＮＣ８９中获得转基因植株．分子生物学检测结果表明，复制酶基因在转基因烟草中获得表达，并转基因烟草表现一定程度的延迟发病作用．

转PRSV复制酶基因T_2代番木瓜植株的抗病性测定

转PRSV复制酶基因的番木瓜植株,其自交及杂交二代植株经PCR检测和Southern blot杂交的结果表明:目的基因整合在番木瓜的染色体上.人工接种PRSV的Ys、Vb、Sm株系于分子检测阳性的7～8叶期植株,转基因植株均表现高抗.在定植田间的9个月中,转基因植株无一发病,而对照则全部发病.

转复制酶基因抗病毒烟草的研究

将携带烟草花叶病毒（TMV）54KD蛋白基因和黄瓜花叶病毒（CMV）3’端缺失0．9kb的复制酶基因片段的植物表达载体pBICT，通过很痛农杆菌311SE系，利用叶圆盘法转化烟草，在含有卡那霉素的选择培养基上诱导生芽、生根，得再生植株53株。移入大田后，选取5株，提取植物总DNA，Southern杂交检测，结果5株中均有复制酶基因的整合，且转基因植株在大田中表现了良好的抗TMV和CMV能力。

马铃薯Y病毒复制酶基因的克隆和序列分析

马铃薯Ｙ病毒复制酶基因的克隆和序列分析彭学贤，项瑜，刘俊君，莽克强（中国科学院微生物研究所，北京１００００８０）ＭｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆＰＶＹＮＩｂｇｅｎｅ￥ＰｅｎＸｕｅｘｉａｎ；ＸｉａｎｇＹｕ；Ｌｉ...

番木瓜环斑病毒复制酶基因转化番木瓜的研究

构建了含番木瓜环斑病毒复制酶（ＰＲＶＲＰ）基因的植物表达载体ｐＲＰＴＷ，导入农杆菌ＬＢＡ４４０４，转化番木瓜，转基因植株经点杂交和ＰＣＲＳｏｕｔｈｅｒｎ检测，证明ＰＲＶＲＰ基因已整合进番木瓜基因组。

番木瓜环斑病毒复制酶(亚基)基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

近二年报道,在TMV、PVX、PEBV和CMV等病毒中,利用病毒编码的复制酶(亚基)基因或相关cDNA片段转化烟草,工程植株获得绝对或极高的病毒抗性。大量研究认为:马铃薯Y病毒组的核内含体大分子量蛋白(NIb)是依赖于RNA的RNA复制酶(或核心亚基),NIb与上述病毒的复制酶有广泛的同源保守区。

特异切割马铃薯卷叶病毒复制酶基因负链的核酶研究

根据锤头状核酶的作用模式，设计、合成并克隆了特异性切割马铃薯卷叶病毒中国分离株（ＰＬＲＶ－Ｃｈ）复制酶基因负链ＲＮＡ的核酶序列。以体外转录的ＰＬＲＶ－Ｃｈ复制酶基因负链ＲＮＡ作为底物，与转录的核酶ＲＮＡ共同保温，以检测核酶对底物的体外切割作用。实验结果表明。

马铃薯Y病毒NIb复制酶基因在转录水平介导的相对广谱抗病性

在大肠杆菌中表达了马铃薯Y病毒中国分离物 (PVY -C)复制酶NIb基因 ,并制备了其抗血清。利用PCR定点突变方法使 NIb 基因移码 - 1位 ,构建了移码 - 1位 NIb 基因 (UN)的植物表达载体。通过土壤农杆菌(AgrobacteriumtumefaciensLBA44 0 4)介导转化烟草NC89,获得 5 1株再生植株。对再生植株的分子检测结果表明 ,转基因烟草中检测到UN基因相应的RNA转录产物 ,推测该基因已经整合到烟草染色体中。攻毒试验发现转UN 基因烟草 (T0 代 )对两个PVY株系和烟草蚀纹病毒的抗病性与转全长、缺失 5′端 381bpNIb 基因烟草 (T2 代 )的相同。Western印迹试验结果表明 ,在本试验检测水平上 ,在转基因T2 代烟草中未检测到NIb基因的表达产物。实验结果支持PVY -C复制酶NIb基因在转录水平上介导相对广谱抗病性的假说。

苜蓿花叶病毒复制酶基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

以侵染苜蓿的苜蓿花叶病毒中国分离株(AlfalfamosaicvirusChineseisolate,A1MV-Ch)RNA2为模板,利用人工合成的特异性引物,进行反转录及PCR扩增,分两段分别扩增了复制酶基因的5′端1.32kb和3′端及其非编码区的1.23kbcDNA序列.用限制性内切酶切割PCR产物后,与pUC19重组,转化大肠杆菌DH5α,筛选重组质粒,用限制性内切酶分析及PCR鉴定,得到分别含有5′端序列和3′端序列的重组质粒,已由上述两种重组质粒构建了含有完整复制酶基因的重组质粒.进行了全序列测定,并与国外报道的A1MV-425株系的相应序列相比较,其复制酶基因编码区核苷酸序列同源性达97.8%,推测的氨基酸序列的同源性达97.6%,3′端非编码区核苷酸序列同源性为98.2%.并将全长复制酶基因与植物表达载体pROK 重组,得植物转化载体pAlMV-FL.

复制酶基因介导的抗病毒烟草植株的研究

将构建的携带烟草花叶病毒（ＴＭＶ）５４ＫＤ蛋白基因及黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）３’端缺失０．９Ｋｂ的１．６Ｋｂ片断复制酶基因植物表达载体ｐＢＩＣＴ，导入根癌农杆菌３１１ＳＥ系，用叶圆盘法转化烟草，在含有卡那霉素的选择性培养基上诱导生芽、生根，得到２８株成活苗．移入大田后，随机挑选４．株植物，提取植物总ＤＮＡ，经ＰＣＲ扩增、Ｓｏｒｔｈｅｒｎ杂交检测，结果４株植物中都有复制酶基因的整合，而未经转化的对照组植物则没有．转基因植株在大田试验中表现了良好的抗烟草花叶病毒及黄瓜花叶病毒能力．

鱼类特异的基因组复制

辐鳍鱼类是脊椎动物中种类最多、分布最广的类群,其基因组大小不等。过去的观点认为,在脊椎动物进化历程中曾发生了两次基因组复制。近期的系统基因组学研究资料进一步提出,在大约350百万年,辐鳍鱼还发生了第三次基因组复制,即鱼类特异的基因组复制(fish-specificgenomeduplication,FSGD),且发生的时间正处在“物种极度丰富”的硬骨鱼谱系(真骨总目)和“物种贫乏”的谱系(辐鳍鱼纲基部的类群)出现分歧的时间点,表明FSGD与硬骨鱼物种和生物多样性的增加有关。进一步开展鱼类比较基因组学和功能基因组学研究将进一步验证FSGD这一假说。