酵母PMT2基因菌株构建及其对复制性寿命的影响

目的研究蛋白质-O-甘露糖转移酶-2(PMT2)基因对酿酒酵母复制性寿命的影响。方法依据基因同源重组原理,构建PMT2基因缺失(pmt2)或基因过表达(PMT2-ox)酵母菌株;实时定量PCR验证菌株中PMT2基因转录水平;显微镜下分离和计数酵母子细胞数目,检测酵母细胞的复制性寿命。结果成功构建PMT2基因缺失或过表达酵母菌株,实时定量PCR证明PMT2 m RNA在pmt2菌株中无表达,在PMT2-ox菌株中表达上调。与野生型酵母细胞的平均寿命(约23代)比较,pmt2菌株的寿命为(25.2±8.9)代,PMT2-ox菌株的寿命为(24.1±7.3)代,寿命无明显延长(P>0.05)。结论酿酒酵母PMT2基因不参与复制性寿命的调控。

酵母PMT1与PMT5双基因缺失对细胞复制性寿命的影响

为研究蛋白质O-甘露糖转移酶-1(Protein O-mannosyltransferase-1,Pmt1p)与Pmt5p基因对酵母细胞寿命的影响,采用一步基因置换法构建PMT5基因缺失菌株(pmt5Δ),在此基础上,缺失PMT1基因,构建PMT1和PMT5双基因缺失菌株(pmt1Δpmt5Δ)。显微镜下分离和计数酵母子细胞的数目,统计菌株的复制性寿命;检测细胞吸光度值来评价细胞分裂增殖速度。结果发现,与对照组酵母细胞的平均复制性寿命(25代)比较,pmt5Δ菌株(26代)的寿命无明显变化(P> 0. 05),而pmt1Δpmt5Δ菌株(21代)的寿命明显缩短(P <0. 01);热量限制条件下,与对照组酵母细胞比较,pmt5Δ菌株的生长曲线无明显变化,而pmt1Δpmt5Δ菌株的生长曲线低平,细胞分裂增殖减慢。结果表明,PMT1与PMT5双基因缺失明显缩短酵母细胞的寿命,机制可能与细胞的增殖活力下降有关。

酿酒酵母PMT1与PMT2双基因过表达菌株构建及其复制寿命研究

目的构建酿酒酵母蛋白质O-甘露糖转移酶PMT1与PMT2双基因过表达菌株,研究其对酵母细胞复制性寿命的影响。方法以PCR技术为基础,通过分子克隆的方法构建PMT2基因表达载体;通过同源重组实现PMT1和PMT2双基因在酵母细胞中过表达;实时定量PCR验证过表达菌株中相关基因的转录水平;光学显微镜下分离和计数酵母目细胞产生子细胞的数目,检测酵母细胞的复制性寿命。结果通过克隆技术成功构建PMT2基因过表达载体(pRS305-PMT2-ox),并转化和筛选出PMT1与PMT2双基因过表达菌株(PMT1ox PMT2ox);转录水平分析证明PMT1和PMT2基因表达上调;复制性寿命检测结果显示:与野生型菌株比较,PMT1ox PMT2ox菌株的平均寿命无明显变化。结论过表达PMT1与PMT2基因不影响酵母菌株的平均复制性寿命,提示PMT1与PMT2双基因过表达不参与酵母复制性寿命的调节。

酵母ATG8与PMT1双基因缺失菌株的构建及鉴定

目的构建自噬相关ATG8与蛋白质O-甘露糖转移酶1(PMT1)双基因缺失酵母菌株。方法一步基因置换法构建ATG8基因缺失菌株(BY4741 atag8::LEU2);通过将不同配型的酵母细胞杂交、显微镜下四分体拆分,平板印记、缺陷型培养基筛选等方法,构建ATG8和PMT1双基因缺失菌株(BY4742 agt8::LEU2 PMT1::URA3);PCR鉴定阳性克隆基因组DNA。结果 ATG8基因缺失菌株电泳条带为2759 bp和980 bp,ATG8和PMT1双基因缺失菌株电泳条带分别为2759 bp,980bp,1630 bp和731 bp。四分体拆分实验发现ATG8基因缺失酵母细胞形成较小的单克隆。结论成功构建ATG8基因缺失菌株和ATG8与PMT1双基因缺失菌株;缺失ATG8基因酵母细胞形成较小的单克隆。

酿酒酵母PMT6基因缺失对细胞寿命的影响

[目的]构建蛋白质O-甘露糖转移酶(Protein O-mannosyltransferase)-6基因缺失酵母菌株,研究其对细胞寿命的影响。[方法]以pRS306质粒为模板,采用一步基因置换方法构建PMT6基因缺失菌株(pmt6Δ);光学显微镜下分离和计数酵母母细胞产生子细胞的数目,检测酵母细胞的复制性寿命;在热量限制条件下(含0.5%葡萄糖培养基),检测酵母细胞分裂增殖速度。[结果]成功构建pmt6Δ菌株;与对照组酵母细胞的复制性寿命(25.2代)比较,pmt6Δ菌株的寿命(25.4代)无明显变化(P>0.05);在热量限制条件下,pmt6Δ菌株的生长曲线低平,细胞分裂增殖减慢。[结论]PMT6基因不参与酵母细胞复制性寿命的调控,而热量限制影响PMT6基因缺失细胞的分裂增殖能力。