烟草曲茎病毒复制相关蛋白基因原核表达条件优化

为了提高烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus,TbCSV)复制相关蛋白(replication-associated protein,Rep)基因在大肠杆菌中表达量,研究了大肠杆菌菌株、温度、诱导时间以及诱导剂IPTG浓度等不同条件对GST-Rep融合蛋白表达量的影响.结果表明,大肠杆菌菌株Rosetta在37℃培养3h后,使用终浓度为0.5mmol·L-1的IPTG在28℃诱导培养4h时,GST-Rep融合蛋白表达量最高,表达的GST-Rep融合蛋白可占细菌总蛋白的42%以上.用GST-Sepharose 4B亲和层析柱对GST-Rep融合蛋白进行纯化,SDS-PAGE表明GST-Rep融合蛋白大小约为66kD,与预计的分子量大小一致,Western blot分析表明其能与GST多克隆抗体起特异性反应.Rep基因的优化表达为研究该基因的作用机理打下了基础.

PCV2 Rep蛋白N-糖基化位点突变对病毒复制的影响

N-糖基化对病毒的感染与增殖均具有重要作用,与PCV2复制相关的Rep蛋白含有三个N-糖基化位点。为了分析PCV2Rep蛋白N-糖基化位点突变对病毒复制的影响,本试验构建了三个双拷贝突变体感染性克隆2M23、2M256、2M286,并成功拯救病毒。通过间接免疫荧光检测病毒的拯救效果,TCID50测定病毒的感染力,荧光定量PCR检测细胞病毒的载量。结果显示,PCV2Rep蛋白的23~25aa、256~258aa N-糖基化位点突变后降低病毒的复制能力,而286~288aa突变后增强病毒的复制能力,为进一步阐明PCV2的复制及致病机制提供参考。

马铃薯A病毒复制相关蛋白研究进展

马铃薯A病毒侵染寄主后的复制主要由推测的复制复合体参与完成,复制复合体蛋白包括RNA解螺旋酶CI、病毒基因组结合蛋白VPg、NIa蛋白酶部分NIaPro和RNA依赖性RNA聚合酶NIb。近年来关于PVA复制复合体蛋白的研究取得了一定的进展,很多蛋白在病毒系统侵染过程发挥的作用及各种蛋白间的互作关系等方面已明确。本文对近年来在PVA病毒复制相关蛋白的结构与功能方面的研究进展进行评述。

腺相关病毒Rep78/68蛋白

腺相关病毒(AAV)编码的非结构蛋白Rep78/68具有抑制病毒和肿瘤转化的作用,并且对宿主细胞的增殖及代谢产生广泛地影响。本文将对此蛋白的最新研究进展进行综述。

拟南芥肌动蛋白相关蛋白基因AtARP5和AtARP6共同参与DNA复制

染色质重塑因子是一类利用ATP水解的能量主动重塑染色质结构的蛋白质,其中的INO80亚家族包括两个在进化中高度保守的重要成员,INO80和SWR1.两者通过结合包括肌动蛋白相关蛋白(Actin-Related Protein,ARP)在内的多个亚基,以复合物的形式对染色质结构动态调控,在真核生物的多个表观遗传调控途径中发挥重要的功能.尽管都属于ARP成员,ARP5是INO80重塑复合物的特异性成员,而ARP6是SWR1重塑复合物的特异性成员.在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中,AtINO80和AtPIE1(拟南芥SWR1)基因缺失的双突变体致死.我们构建了AtARP5和AtARP6缺失突变体的双突变体atarp5-2 atarp6-1,用以研究两者在植物生长发育中的功能互作.我们发现,相对于野生型植物和各自的单突变体,双突变体atarp5-2 atarp6-1植物生长明显受抑制.细致的细胞观察显示,双突变体植物叶肉栅栏细胞大小和数量都减小,植物细胞核倍性下降,细胞周期和DNA复制相关基因的转录水平异常上调.Pull-down实验和BiFC实验证实,AtARP5和AtARP6都能够与DNA解旋酶RVB1结合.由于RVB1对于细胞增殖和植物生长至关重要,因此两个不同的肌动蛋白相关蛋白可能依赖于RVB1协同调控DNA复制以及相关细胞周期进程.

HIV-I编码病毒蛋白R基因在真核细胞中的表达及其表达蛋白对KSHV溶解性周期复制的影响

目的:构建含人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)编码病毒蛋白R(Vpr)基因的重组真核表达质粒并初步探索Vpr基因编码蛋白对卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)溶解性周期复制的影响。方法:构建pVpr-Flag重组质粒并进行酶切鉴定和序列测定;将pVpr-Flag重组质粒临时转染BCBL-1和NIH3T3细胞,采用RT-PCR、IFA和Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测Vpr基因的表达情况;提取临时转染pVpr-Flag重组质粒的BCBL-1细胞总RNA,进行RT-PCR检测KSHV次要衣壳蛋白编码基因ORF26(仅在病毒裂解期表达)mRNA转录水平,初步探索HIV-1Vpr基因编码蛋白对KSHV复制的影响。结果:克隆的Vpr基因序列与GenBank中已登记的Vpr序列100%同源。RT-PCR、IFA和Western blot结果显示Vpr基因mRNA及其编码蛋白在真核细胞中得到了转录和表达。RT-PCR结果进一步显示,Vpr基因编码蛋白能够降低KSHV ORF26 mRNA转录水平。结论:成功构建含Vpr基因序列的重组质粒并在真核细胞中获得正确表达;初步探索表明Vpr蛋白能够抑制KSHV溶解性周期复制。

猪圆环病毒2型ORF1部分位点突变对病毒复制能力的影响

猪圆环病毒2型(PCV2)可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征,导致仔猪逐渐消瘦。PCV2 ORF1表达的Rep蛋白及其剪切体Rep′是PCV2复制所需的重要蛋白。为了研究PCV2 ORF1部分位点对PCV2复制能力的影响,本试验通过构建PCV2 ORF1区域点突变双拷贝感染性克隆质粒,在无PCV2污染的PK-15细胞中进行病毒拯救,使用荧光定量PCR检测不同位点突变病毒培养不同代次上清液的Ct值。结果:将PCV2 Rep的17 aa、19 aa、20 aa和21 aa突变为丙氨酸后病毒无法成功拯救,2 aa突变后严重影响病毒的复制能力,3 aa、5 aa和18 aa突变后病毒的复制能力增强且细胞病毒载量高于PCV2原毒株,推测17 aa、19 aa、20 aa和21 aa是影响PCV2复制的关键作用位点。本研究结果为未来PCV2复制相关研究提供了试验依据。

血清HBsAg定量检测与乙型肝炎病毒复制的相关性研究进展

HBV外膜蛋白是HBV颗粒的外膜组成部分，是决定病毒吸附至易感细胞受体的成分，编码包膜蛋白的基因分为前S1、前S2及S三个编码区，分别编码前S1蛋白、前S2蛋白及HBsAg。HBsAg是一种跨膜糖蛋白，在HBV感染时大量释放到患者血清中。

乙肝病毒大蛋白与HBV—DNA及HBV血清学标志物的相关性及意义探讨

乙型肝炎在我国有较高的发病率。其实验室检查方法长期以来主要有FO法测定HBV—DNA、酶联免疫法检测HBV血清标志物。近年来随着对乙肝表面抗原大蛋白前S区抗原在乙肝发病机理、复制、感染等方面研究的深入，逐渐认识到乙肝表面抗原前S区具有越来越重要的临床意义。我们利用针对折叠后前S区构象表位检测大蛋白的HBV—LP试剂，通过对154例乙肝患者血清进行乙肝病毒大蛋白、HBV—DNA、乙肝病毒血清标志物检测、探讨这些指标之间的关系及其在乙肝病毒复制、病情判断及传染性等方面的临床意义。

γ疱疹病毒亚科肿瘤形成相关蛋白的研究进展

疱疹病毒普遍存在于动物中,分为α、β、γ 3个亚科.γ亚科的多种病毒都具有诱导宿主形成肿瘤的能力.本文讨论了EB病毒、卡波西肉瘤相关疱疹病毒和鼠猴疱疹病毒等3种病毒中参与细胞转化、信号转导、病毒基因组复制和细胞增殖相关基因的结构和功能.

霉酚酸酯治疗乙肝病毒相关性肾炎的临床研究

目的前瞻性研究霉酚酸酯(MMF)治疗乙型肝炎病毒相关性肾炎的临床疗效和安全性。方法选择血清HBV标记物阳性、病理诊断为乙型肝炎病毒相关性肾炎的患者共18例,随机分为两组,每组9例,第一组采用MMF联合皮质激素治疗方案,MMF初始剂量1.0～1.5g/d,同时口服强的松0.5～0.8mg·kg-·1d-1。第二组采用皮质激素治疗,强的松0.5～0.8mg·kg-·1d-1。两组中有HBV蛳DNA复制的均给予干扰素蛳α或拉米夫定治疗。结果①治疗3个月时,MMF组尿蛋白定量如(2.7±2.5)g/d较治疗前的(4.9±2.9)g/d明显减少(P<0.05),血浆白蛋白为(34.7±7.3)g/L较治疗前的(26.0±6.2)g/L明显升高(P<0.05);对照组尿蛋白定量和血浆白蛋白与治疗前相比无显著改善(P>0.05)。治疗6个月时,MMF组尿蛋白定量为(1.4±0.7)g/24h较治疗前的(4.9±2.9)g/24h明显减少(P<0.01),血浆白蛋白为(35.1±5.6)g/L较治疗前的(26.0±6.2)g/L明显升高(P<0.01)。对照组尿蛋白定量为(2.7±1.6)g/24h较治疗前的(5.6±2.2)g/24h明显减少(P<0.05),血浆白蛋白为(33.8±9.5)g/L较治疗前的(26.2±6.0)g/L显著升高(P<0.05)。治疗6个月时MMF组尿蛋白定量为(1.4±0.7)g/24h显著低于对照组的(2.7±1.6)g/24h(P<0.05)。MMF组6个月时的完全缓解率(44.4%)与对照组(11.1%)比较无显著性差?

痘病毒锚蛋白重复序列蛋白对NF-кB信号通路的影响

痘病毒科（Poxviridae）病毒是在细胞质中复制的双链DNA病毒,拥有130 kb～〉350 kb的基因组。分为两个亚科：脊椎动物痘病毒亚科（Chordopoxvirinae）和昆虫痘病毒亚科（Entomopo-xvirinae）。脊椎动物痘病毒亚科包含10个属。痘病毒间的基因组结构有很高的相似性,病毒DNA复制和转录所必需的基因以及涉及病毒粒子形态和结构的基因位于基因组高度保守的中间区域。基因组的末端区域在不同的属间呈现很大的多样性，包括一些属或种特异性基因以及感染和毒力相关基因。

内毒素性急性肺损伤大鼠肺组织p38 mRNA及其蛋白质表达的变化

目的探讨内毒素性急性肺损伤 (ALI)大鼠肺组织p38mRNA及其磷酸化蛋白质表达的变化。方法静脉注射脂多糖 (LPS)复制大鼠ALI模型。分别采用原位分子杂交和蛋白质印迹方法检测肺组织 p38mRNA及其磷酸化蛋白质的表达 ,并观察肺组织病理学改变。结果正常大鼠肺组织有少量p38mRNA表达 ,可见于平滑肌细胞、内皮细胞、肺泡上皮细胞和肺泡巨噬细胞。静脉注射LPS 2小时能成功复制ALI模型 ,PaO2 显著下降 (p <0 .0 1) ,p38mRNA及其磷酸化蛋白质表达显著增加 ,分别为正常对照组的 2 .34和 2 .74倍 (p <0 .0 1)。通过直线相关分析发现 ,PaO2 与肺组织 p38mRNA和磷酸化p38MAPK表达之间分别呈显著负相关 (r=- 0 .6 5 2 ,- 0 .713,p均 <0 .0 1)。结论内毒素性肺损伤肺组织 p38mRNA及其磷酸化蛋白质的表达均上调 ,可能与ALI的病理生理过程有关。

囊泡相关膜蛋白A调控牛病毒性腹泻病毒复制

[背景]牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)是致犊牛腹泻的重要病原之一,而目前BVDV与宿主因子互作机理研究较少,成为限制BVDV防控的重要原因。[目的]探明囊泡相关膜蛋白A(vesicle-associated membrane protein A,VAPA)对BVDV复制的影响。[方法]根据GenBank中VAPA基因,使用Benchling和CHOPCHOP等平台设计靶向VAPA的向导RNA(small guide RNA,sgRNA),融合后克隆至慢病毒lentiCRISPR v2载体中,包装慢病毒后感染牛肾细胞(Madin-Darby bovine kidney,MDBK),使用嘌呤霉素连续筛选5代,使用Western Blot检测VAPA蛋白敲除(knockout,KO)情况;BVDV感染VAPA KO细胞不同时间后,收集细胞提取总RNA,并将等质量的RNA反转录成cDNA,使用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)和免疫荧光分析(immunofluorescence assay,IFA)分别检测BVDV 5’-非翻译区(untranslated region,UTR)mRNA水平和双链RNA(double strand RNA,dsRNA)积累水平,于BVDV感染后不同时间观察致细胞病变(cytopathic effect,CPE)情况,并收集子代病毒液,使用Reed-Muench法计算子代病毒滴度变化。接种等量VAPAKO和乱码序列对照scramble细胞后不同时间进行活细胞计数,检测VAPA KO是否影响细胞活性。[结果]慢病毒感染后使用嘌呤霉素筛选,Western Blot检测VAPA蛋白明显降低,成功获得VAPAKO细胞;与对照scramble细胞相比,BVDV感染VAPAKO细胞后5’-UTR mRNA水平和dsRNA积累量均显著性降低,BVDV感染造成的CPE明显推迟并减轻,子代病毒滴度在12 h和36 h显著下降,在48 h极显著下降;与scramble细胞相比,VAPA KO细胞活性未受影响。[结论]VAPAKO后显著性抑制BVDV复制,为BVDV防控新技术的建立提供重要靶标。

开展乙肝病毒核酸相关抗原（HBV—NRA）前相关临床分析

我国属于乙型肝炎病毒（HBV）感染高流行区，一般人群的HBsAg阳性率高达9．09％，隐匿型乙型肝炎和乙肝肝炎病毒变异的存在，要求检测乙肝病毒方法和手段也越来越高。乙型肝炎病毒载量（HBV—DNA）与乙肝病毒前S1蛋白（Pre—S1）以及乙肝病毒核心抗原（HBcAg）均是反映乙肝病毒复制的敏感指标。

细胞周期蛋白激酶9（CDK9）对卡波氏肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）裂解复制周期的影响

目的 探讨细胞周期蛋白激酶9（cyclin-dependent kinase 9，CDK9）在卡波氏肉瘤相关疱疹病毒（Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV）裂解复制周期中的作用。方法 分别应用CDK9特异性抑制剂FIT-039处理或CDK9小干扰RNA（siRNA）转染iSLK.219及TREx-K-Rta BCBL-1细胞，四环素（Dox）或佛波酯（TPA）和丁酸钠刺激48 h后，分别采用荧光显微镜和实时定量PCR（qPCR）方法观察红色荧光蛋白（RFP，病毒裂解复制）阳性细胞数目及KSHV相关基因的mRNA转录水平。染色质免疫沉淀（ChIP）试验检测KSHV PAN启动子上RNA PolⅡ及其磷酸化CTD-S2的富集含量。结果 FIT-039处理和CDK9-siRNA转染后，iSLK.219细胞RFP阳性率显著降低、TREx-K-Rta BCBL-1细胞中KSHV裂解复制周期相关基因ORF50、PAN及K2的mRNA转录水平明显下降。且FIT-039处理后，TREx-K-Rta BCBL-1细胞中KSHV PAN启动子上结合的RNA PolⅡ及其磷酸化CTD-S2含量显著下降。结论 CDK9可能通过磷酸化RNA PolⅡ丝氨酸调控KSHV病毒裂解复制。

细胞自噬相关蛋白ATG9A对口蹄疫病毒侵入的影响

为揭示细胞自噬相关蛋白9A(ATG9A)对口蹄疫病毒(FMDV)复制的影响,利用IFA、RT-qPCR和Western-blot等方法检测FMDV与ATG9A的共定位情况以及病毒感染对ATG9A的影响;通过构建ATG9A重组表达质粒和合成小干扰RNA,检测过表达及敲降ATG9A对FMDV吸附、内化、基因组复制、蛋白翻译、子代病毒粒子产生的影响。结果显示,FMDV感染后与ATG9A共定位且抑制ATG9A的表达;ATG9A不影响FMDV的吸附,但极显著地抑制FMDV的内化过程;同时,过表达(或干扰)ATG9A能够在RNA与蛋白水平显著降低(或提高)FMDV的增殖和子代病毒粒子产生的能力。结论,ATG9A抑制FMDV的复制,为深入认识FMDV在细胞内的复制周期提供了线索。

链霉菌中一类同源非典型端粒的克隆及分析

采用自连接-PCR的方法克隆和测序了Streptomyces cattleya DSM46488、Streptomyces mobaraensisDSM40847及Streptomyces davawensisJCM4913的端粒,序列比对发现,这3种端粒具有较高的序列相似性,前60个核苷酸的序列相似性达到了80%以上;在二级结构水平,这些端粒含有多个回文序列,其中,包含相同的回文序列I和II,但并不能通过折返形成超级发夹结构;Streptomyces cattleya DSM46488、StreptomycesmobaraensisDSM40847及Streptomyces davawensis JCM4913的端粒与线性质粒pSHJG1端粒及Streptomyces albus J1074染色体端粒均具有较高的序列相似性;系统发育分析显示它们与典型端粒及其他非典型端粒处于不同的进化分支,S.cattleyaDSM46488、S.mobaraensis DSM40847、S.davawensisJCM4913、S.albus J1074及S.hydroscopicussubsp.Jinggangensis 5008都编码同源的潜在末端蛋白-端粒相关蛋白,暗示了这类同源的非典型端粒系统广泛存在于链霉菌中。

腺相关病毒(AAV)及其编码的Rep蛋白治疗肿瘤的研究进展

腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)是单链DNA病毒。AAV基因载体由于安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫原性低,在体内表达外源基因时间长等特点,被视为最有前途的基因转移载体之一,在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。AAV编码的非结构蛋白Rep具有抑制肿瘤和病毒的作用,并可以对宿主细胞周期和增殖产生重要影响。Rep蛋白也可以对许多异源启动子产生抑制效果,并同时对胞内许多转录原件产生影响。文章就AAV的基本生物学特性和其Rep蛋白在肿瘤治疗方向的最新进展进行了综述。

组蛋白修饰对酿酒酵母复制起始相关蛋白基因表达的调控

真核生物的DNA复制是一个复杂且有序的过程,其中DNA复制起始参与调控众多生物学活动,对生物正常的生长发育具有重要作用。组蛋白修饰在调节DNA复制过程中具有重要作用。为了检测组蛋白特定位点的修饰对DNA复制起始的影响,本研究以酿酒酵母组蛋白H3/H4定点突变菌株为研究对象,采用倍比稀释表型分析法检测了组蛋白11种H3/H4甲基化、乙酰化突变菌株的生长情况,显示,以野生型菌株BY4741为对照,组蛋白H3/H4乙酰化突变菌株H3K64A、H3K56A、H3K14Q、H4K5R、H4K16Q以及组蛋白H4甲基化突变菌株H4K20Q表现为生长缺陷,其他菌株与BY4741生长情况基本一致;通过GeNorm和NormFinder软件分析得出本实验最适内参基因为β-actin;采用Real-time PCR检测了菌株细胞内复制起始相关蛋白基因mcm2、mcm10、cdc45的表达情况,表明,组蛋白H3/H4甲基化突变菌株H3K9A、H3R72K、H4K59A、H4K20Q胞内mcm2、mcm10、cdc45基因表达均显著下调(p<0.01),而H4R3A胞内mcm2、mcm10表达显著上调(p<0.05)、cdc45显著下调(p<0.01),组蛋白H3/H4乙酰化突变菌株H3K14Q、H4K5R、H4K8A、H4K16Q胞内mcm2表达显著下调(p<0.01),而在H3K64A、H3K56A胞内无显著变化,mcm10在6种组蛋白H3/H4乙酰化突变菌株内表达均下调(p<0.01),cdc45基因在H4K5R胞内表达无显著变化,在其余5种乙酰化突变菌株中表达均显著下调(p<0.01),为进一步阐明组蛋白特定位点修饰调控DNA复制起始的深入研究提供理论帮助。