复制缺陷型重组腺病毒rvAdG1VP7免疫学效果的研究

目的 对 1株可表达A组轮状病毒主要结构抗原VP7的重组腺病毒rvAdG1VP7的体内免疫学效果进行研究。方法 通过灌胃和滴鼻 2种途径对BALB/c小鼠进行免疫 ,并对免疫后小鼠体液和黏膜免疫进行分析。结果 初次免疫后 ,2组小鼠均有应答 ,但血清IgG抗体滴度及阳转率不同。再次免疫后 ,显示出明显的加强效果。除了血清IgG外 ,小鼠还产生了较强的针对轮状病毒的血清IgA。滴鼻组在肺灌洗液和肠匀浆液中均可检测到SIgA ,灌胃组仅在肠道检测到SIgA。滴鼻组的免疫学效果明显优于灌胃组。对滴鼻组小鼠肺灌洗液IgG/SIgA的阳转率进行了比较 ,发现IgG的应答水平明显高于SIgA。免疫后小鼠血清中IgG的动态观察表明 ,抗体可长期持续至少半年以上。 结论 重组腺病毒载体rvAdG1VP7所取得的良好免疫学效果 ,为我国具有自主知识产权的新型轮状病毒基因工程疫苗的进一步研制奠定了基础。

表达狂犬病毒糖蛋白基因复制缺陷型重组腺病毒的构建及其特性

目的构建表达狂犬病毒CVS-N2C毒株糖蛋白(GP)基因的复制缺陷型重组腺病毒,作为筛选狂犬病毒基因工程疫苗的基础。方法用大肠杆菌细胞内同源重组技术构建重组病毒;NorthernblotWesternblot和免疫荧光抗体等方法鉴定重组病毒。结果重组病毒具有典型的病毒形态;病毒基因组稳定;GP基因可被转录;重组病毒表达的GP蛋白相对分子质量为66000,与天然GP相对分子质量相符表达的GP蛋白可被兔抗狂犬病毒免疫血清特异性识别;小鼠免疫-攻击试验可保护87.5%～100%动物。结论成功地构建了表达狂犬病毒CVS-N2C毒株GP基因的复制缺陷型重组腺病毒,并表现了良好的免疫效果。

重组复制缺陷型腺病毒基因治疗肝纤维化的研究与应用

肝纤维化的特征性变化是肝内细胞外基质的过多沉积.抑制肝星形细胞的激活和细胞外基质的合成,促进基质降解和肝细胞再生是肝纤维化治疗的重要方法.近年来,针对上述环节构建重组复制缺陷型腺病毒,表达不同外源基因产物基因治疗肝纤维化研究取得了较大的进展.本文对重组腺病毒的结构、构建以及抗肝纤维化作用和安全性研究作一综述.

细菌内快速构建两种用于肝纤维化基因治疗的重组复制缺陷型腺病毒

目的 :在大肠杆菌内快速构建两种分别含有人肝细胞生长因子 (hepatic growth factor,HGF)和非分泌型人尿激酶型纤溶酶原激活剂 (urokinase- type plasm inogen activator,u PA) c DNA片段的重组复制缺陷型腺病毒。方法 :分别将人 HGF和 u PA c DNA片段与穿梭载体 p Track- CMV连接 ,线性化后与骨架载体 Ad Easy- 1在大肠杆菌 BJ5 183内同源重组获得腺病毒载体 p Ad HGF和 p Adu PA,经 2 93细胞包装后得到复制缺陷型重组腺病毒 Ad HGF和 Adu PA;将 Ad HGF和 Adu PA分别体外感染肝细胞株 L0 2 ,以 Northern印迹法和 Western印迹法检测两种病毒在肝细胞中的表达。 结果 :连接、重组后通过酶切和测序法筛选出病毒质粒 p Ad HGF和 p Adu PA;经 2 93细胞包装 ,3d后均观察到绿色荧光蛋白明显表达 ,Cs Cl梯度离心纯化最终分别获得 4× 10 1 0 efu/ m l滴度的重组病毒 Ad HGF和 6× 10 1 0 efu/ ml Adu PA;两种病毒体外感染肝细胞 3d后 ,HGF和u PA表达均明显增加。结论 :细菌内同源重组制备复制缺陷型腺病毒 ,纯化过程简单 ,重组腺病毒在肝细胞中均高效表达 。

人IL-2复制缺陷型重组腺病毒的构建和鉴定

目的构建含hIL-2的复制缺陷型重组腺病毒。方法将hIL-2DNA片段与载体pDNR-Dual-CMV融合,转化大肠杆菌DH5α。得到重组质粒(pDNR-Dual-hIL-2),经鉴定正确,将pDNR-Dual-hIL-2质粒与pLP-Adeno-x-CMV质粒重组得到重组载体pLP-Adeno-hIL-2,再次转化大肠杆菌DH5α,挑取正确克隆,大量扩增,提取质粒。将此质粒经PacⅠ酶切后与LipofectamineTM2000转染HEK293细胞,产生含人IL-2的复制缺陷重组腺病毒(AdhIL-2)。结果pLP-Adeno-hIL-2重组载体经PCR、酶切鉴定结果与预期相符,所得重组病毒滴度达到5×107PFUml。结论成功构建了hIL-2的复制缺陷型重组腺病毒。

表达大熊猫源犬瘟热病毒H蛋白复制缺陷型重组腺病毒的构建及鉴定

为构建能够表达大熊猫源犬瘟热病毒(CDV)分离株giant panda/SX/2014 H蛋白的复制缺陷型重组腺病毒,利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增株giant panda/SX/2014 H基因,通过TOPO连接克隆至入门载体pENTR/D-TOPO,得到重组入门质粒pENTR/D-TOPO-CDV-H,然后与腺病毒骨架载体pAd/CMV/V5-DEST进行LR重组,获得重组质粒pAd-CDV-H;重组质粒用PacⅠ酶切线性化后转染293A细胞,获得重组腺病毒rAd-CDV-H,连续传代后对获得的重组腺病毒分别进行病毒滴定、免疫荧光和Western blot鉴定。经免疫荧光方法及Western blot鉴定结果表明,重组腺病毒rAd-CDV-H感染293A细胞、Vero细胞后均可以成功表达H蛋白,获得的重组腺病毒的滴度高达1010IFU/mL。成功获得能够表达大熊猫源CDV H蛋白的重组腺病毒rAd-CDV-H,在进一步证明其安全有效后,可为大熊猫犬瘟热免疫预防提供候选疫苗株。

抗HBc-ScFv基因复制缺陷型腺病毒载体的构建及其体外表达

目的:构建表达抗乙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体(抗HBc ScFv)的复制缺陷型腺病毒载体,并检测其能否在真核细胞中有效表达目的基因. 方法:采用DNA重组技术将特异性人源性抗卜HBc单链抗体基因克隆于腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,与5 型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共转染B15183细菌,经细菌内同源重组产生携带抗HBc ScFv基因的重组腺病毒载体pAd—ScFV,经脂质体法转染293细胞,包装产生携带抗HBc scFv基因的重组腺病毒Ad—scFv,体外转染HepG2细胞,PCR和ELISA法检测目的基因及其表达. 结果:构建了表达抗HBc ScFv基因的复制缺陷型腺病毒,病毒滴度达4×1015 PFU/L,并能在真核细胞中有效表达目的基因. 结论:成功构建表达抗HBc ScFv的复制缺陷型腺病毒载体,为进一步开展抗HBc ScFv在抗HBV基因治疗中的作用研究提供实验基础.

抗KDRscFv复制缺陷型腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建抗KDRscFv复制缺陷型腺病毒载体,为抗KDRscFv抗肿瘤血管生成的体内应用打下实验基础。方法采用重叠延伸PCR方法构建IL-2信号肽及抗KDRscFv融合基因,克隆于腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,转染含pAdEasy-1的BJ5183细菌,经细菌内同源重组产生携带抗KDRscFv基因(含信号肽)的重组腺病毒载体pAd-抗KDRscFv,经脂质体法转染293细胞,包装产生携带抗KDRscFv基因的重组腺病毒Ad-抗KDRscFv。结果构建了表达抗KDRscFv基因的复制缺陷型腺病毒,且该重组腺病毒能在肝癌细胞株HepG2中高效表达。结论成功构建表达抗KDRscFv基因的复制缺陷型腺病毒载体,为进一步研究抗KDR-scFv在肿瘤治疗中的作用研究提供实验基础。

表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的重组复制缺陷型HAdV-5的构建及鉴定

【目的】采用AdEasy系统构建能表达传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)VP2蛋白的重组复制缺陷型人5型腺病毒(Human adenovirus serotype-5,HAdV-5),以期为IBDV活载体疫苗的研发提供新的思路。【方法】通过同源重组将VP2基因克隆至穿梭质粒pAdTrack-GOI构建重组穿梭质粒pAdTrack-VP2;PmeⅠ酶线性化pAdTrack-VP2后热击转化大肠杆菌BJ5183-AD-1感受态细胞,利用菌内同源重组构建重组腺病毒质粒pAd-VP2;将pAd-VP2经PacⅠ酶线性化和纯化后转染HEK293A细胞,包装表达VP2蛋白的重组复制缺陷型HAdV-5 (rAd5-VP2),将鉴定正确的重组病毒感染非复制型细胞(Vero、CEF和DF1细胞)并分析目的蛋白的表达情况。【结果】将rAd5-VP2通过HEK293A细胞扩大培养,测得第10代病毒的滴度为7.9×10~9 IFU/mL;RT-PCR结果显示,VP2基因在重组腺病毒中能稳定翻译;Western blotting和间接免疫荧光试验均检测到VP2蛋白的表达,蛋白分子质量为41 ku;将rAd5-VP2感染Vero、CEF和DF1细胞也检测到VP2蛋白的表达,表明HAdV-5有作为IBDV活载体疫苗研发的可能性。【结论】本研究构建了重组复制缺陷型HAdV-5,该毒株能感染部分哺乳动物细胞和家禽细胞并能检测到目的蛋白的表达。

人SPK1基因的重组腺病毒载体感染效率及表达特性研究

目的研究重组腺病毒载体感染小鼠神经瘤细胞(N2a)的感染效率及重组腺病毒介导的人鞘氨醇激酶-1(sphingosine kinase-1,SPK1)基因在N2a细胞表达特性。方法用流式细胞仪检测感染效率,用激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白的表达;用Western blot方法检测SPK1蛋白的表达。结果 N2a细胞的感染效率和绿色荧光蛋白表达量在一定范围内随着病毒感染复数(Multiplicity of infection,MOI)的增加而增高,MOI为100时感染效率达峰值为(99.57±0.133)%。以MOI为25的重组腺病毒感染N2a细胞,感染效率随时间变化(0-72h)而增高,72h峰值为(98.03±0.721)%,到96h有所降低(P<0.05)。SPK1蛋白的表达量较感染空病毒组和未感染病毒组明显升高。结论重组腺病毒在适宜的MOI下,在N2a细胞中96小时内均有较高的感染效率,且重组腺病毒介导的人SPK1基因在体外能够得到有效的表达。

含HIV-1 gag、gag V3基因的重组腺病毒伴随病毒的构建及其免疫原性的研究

将HIV - 1中国株 42 (B亚型 )的 gag 基因及 gag与 gp12 0V3区的嵌合基因 gagV3插入腺病毒伴随病毒(AAV)表达载体pSNAV质粒中 ,构建重组质粒 pSNAV gag及pSNAV gagV3;采用脂质体转染的方法分别将重组质粒转入BHK细胞 ,G418筛选得到转入重组质粒并能表达外源基因的细胞系 ,命名为BHK gag及BHK gagV3。用具有重组腺病毒伴随病毒 (rAAV)包装功能的一种重组单纯疱疹病毒 (rHSV)分别感染这两株细胞系 ,纯化后得到rAAV ,电镜观察可见到大量实心病毒颗粒 ,核酸杂交检测重组病毒滴度达到 10 12 病毒颗粒 /ml,重组病毒感染2 93细胞 ,ELISA检测有 gag 及 gagV3基因的表达。用重组病毒免疫Balb/C小鼠 ,检测抗体及细胞免疫水平 ,证明重组病毒可以在小鼠体内诱导产生细胞及体液免疫。

含Egr-1启动子和Smad7基因的重组腺病毒的构建

目的 :构建含Egr 1启动子和Smad7cDNA的重组复制缺陷型腺病毒并初步验证其活性 ,为下一步的基因治疗奠定基础。方法 :以Adeno XTM表达试剂盒为基础 ,应用分子克隆技术 ,将穿梭质粒pShuttle的CMV启动子替换为Egr 1启动子 ,再将Smad7cDNA亚克隆至穿梭质粒内 ,然后与腺病毒DNA重组 ,转化大肠杆菌E .coliDH5α ,PCR鉴定正确即为pAdES。脂质体法转染HEK2 93细胞 ,包装出完整腺病毒 ,然后大量扩增测定滴度。重组腺病毒感染成纤维细胞 (3T6 ) ,经深部X线照射后通过免疫细胞化学方法检测Smad7蛋白在细胞内的表达定位。结果 :经酶切、PCR及测序鉴定证实成功构建了含Egr 1启动子和Smad7的重组复制缺陷型腺病毒pAdES。病毒滴度为 1.0× 10 11TCID50 /ml。细胞免疫化学结果显示Smad7蛋白表达定位于细胞质内。结论 :利用Adeno XTM 表达试剂盒 ,通过分子克隆体外重组技术可以方便的构建重组腺病毒载体 ,并能在HEK2 93细胞内成功包装和扩增。

小鼠sFlt重组腺病毒抑制小鼠Lewis肺癌的生长

背景与目的实体肿瘤组织的生长具有血管依赖性,肿瘤新生血管生成已证实为肿瘤生长的控制点之一。本研究拟探讨编码小鼠可溶性血管内皮生长因子受体1(sFlt1)的复制缺陷型腺病毒对肿瘤新生血管和肿瘤生长的影响。方法应用小鼠Lewis肺癌细胞(LLC)株建立肺癌模型进行抗肿瘤的研究,以编码sFlt1的复制缺陷型重组腺病毒(sFlt1Adv)作为治疗组,编码绿色荧光蛋白的复制缺陷型重组腺病毒(GFPAdv)和生理盐水作为对照组,皮下接种小鼠LLC一周后,经尾静脉给药2次(间隔2周),第二次给药后2周,处死全部实验鼠,剥离肿瘤组织并称重,用3%多聚甲醛固定,用抗CD31作免疫组织化学染色。结果sFlt1Adv治疗组肿瘤明显小于GFPAdv对照组和生理盐水组(P<0.01),其抑瘤率达到71.8%;治疗组的肿瘤微血管密度低于GFPAdv对照组和生理盐水组(P<0.01)。结论复制缺陷型重组腺病毒能抑制肿瘤组织的新生血管形成,从而抑制肿瘤的生长,有较好的应用价值。

重组TRAIL腺病毒抑制肺癌细胞生长和诱导凋亡的作用

目的:研究重组TRAIL腺病毒(Ad-TRAIL)对人非小细胞肺癌细胞株YTMLC、A549、H460抑制生长和诱导凋亡的作用,探讨Ad-TRAIL用于非小细胞肺癌基因治疗的可能性。方法:培养肿瘤细胞,分别加入Ad-TRAIL、sTRAIL,并设Ad、PBS作对照。倒置显微镜、吖啶橙染色后荧光显微镜、电镜进行细胞形态结构观察;肿瘤细胞生长抑制实验检测细胞存活率,绘制肿瘤细胞生长抑制曲线;DNA凝胶电泳、PI染色、TUNEL染色和流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡;集落形成实验观察肿瘤细胞集落形成能力。结果:Ad-TRAIL组、sTRAIL组与空腺病毒Ad组、PBS阴性对照组相比均明显抑制非小细胞肺癌细胞株YTMLC、A549、H460的增殖。DNA凝胶电泳出现DNA梯形条带;形态学观察发现Ad-TRAIL组的肿瘤细胞具有细胞凋亡的形态;Ad-TRAIL作用的YTMLC细胞有较高比例(8.55%)的亚二倍体凋亡峰,而Ad和PBS组分别为1.08%和0.47%;Ad-TRAIL组被TUNEL标记的细胞比例为10.6%,高于Ad组的1.13%。Ad-TRAIL组的集落数为28±7,而PBS和Ad对照组分别为257±18,193±12。结论:Ad-TRAIL对非小细胞肺癌细胞具有抑制生长和诱导凋亡的作用,Ad-TRAIL有可能用于非小细胞肺癌的基因治疗。

多基因联合重组腺病毒对喉癌细胞生长的影响

目的探讨携带多基因(抑癌蛋白:p53,免疫共刺激分子:B7–1,粒细胞巨噬细胞集落刺激因子:Granulocyte-MacrophageColony-StimulatingFactor,GM-CSF)的复制缺陷型腺病毒(BB-102)对喉鳞癌原代细胞中的表达效率和对其生长的抑制作用。方法构建多基因联合(p53,GM-CSF,B7-1)重组的复制缺陷腺病毒BB–102,在体外感染两株喉鳞癌细胞系(LSC-1及L-17),采用免疫组化,流氏细胞术,ELISA等检测目的基因编码蛋白效率,用MTT法观察其对喉癌细胞生长抑制作用。结果三种目的基因在喉癌细胞中均有不同程度的表达:B7-1从平均1.34%提高到57%;GM-CSF在转染后24小时即开始升高,持续两天后低水平维持在一周时间;p53蛋白表达明显,但当50pfu/细胞的相同浓度转染时,其表达效率没有Ad-p53高。BB-102和Ad-p53分别对肿瘤细胞生长产生抑制作用,两者没有显著差异(P>0.05)。结论BB-102感染喉癌细胞,目的基因都能有效表达,喉癌原代细胞生长受到明显抑制;感染滴度相同时,单基因腺病毒Ad-p53感染的肿瘤细胞p53蛋白表达丰度比BB-102高。

重组腺病毒对Hela、MCF-7的转染效率及其介导的hTRAIL基因体外抑瘤作用

目的研究重组腺病毒感染宫颈癌细胞Hela和乳腺癌细胞MCF-7的转染效率,并观察重组腺病毒介导的人肿瘤坏死因子(TNF)相关诱导凋亡配体(hTRAIL)基因对Hela、MCF-7生长的影响。方法将Hela和MCF-7细胞接种至12孔板,培育24h后加入不同感染滴度的重组腺病毒Ad-CMV-EGFP,用流式细胞仪检测其转染效率;将Hela细胞和MCF-7细胞接种至96孔板,24h后转染重组腺病毒Ad-CMV-hTRAIL,72h用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测肿瘤细胞的存活率。结果Ad-CMV-EGFP对Hela和MCF-7细胞的转染效率在一定范围内随着感染复数(MOI)的增加而增高,转染Ad-CMV-hTRAIL的Hela细胞的存活率明显低于转染Ad-CMV-EGFP的病毒对照组(P<0.05)。结论腺病毒对Hela和MCF-7细胞均有较高的转染效率,且腺病毒介导的hTRAIL基因对Hela细胞具有明显的体外抗瘤作用。

携带人可溶性TRAIL基因的重组腺病毒在肺癌细胞中的转染效率及表达特性研究

目的研究重组腺病毒感染肺腺癌细胞A549的转染效率及重组腺病毒介导的人可溶性肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体(hTRAIL95-281)基因的体外表达。方法用不同感染滴度(MOI)(0-10 000 VP/cell)的重组腺病毒Ad-CMV-EGFP转染A549细胞后48 h收集细胞,经流式细胞仪检测其转染效率,并在共聚焦荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达;用MOI为5 000 VP/cell的Ad-CMV-EGFP感染肿瘤细胞后不同时间(24 h、48 h、72 h和96 h)收集细胞,经流式细胞仪检测其转染效率;用重组腺病毒Ad-CMV-hTRAIL95-281感染293T细胞后不同时间收集培养物用ELISA方法检测上清中的TRAIL表达。结果重组腺病毒载体对A549细胞的转染效率和绿色荧光蛋白表达在一定范围内随着MOI的增加而增高,MOI为5 000 VP/cell时转染效率达峰值,MOI为10 000 VP/cell时转染效率反而降低。重组腺病毒转染A549细胞后72 h内转染效率随时间的变化而增高,峰值为98%,96 h有所降低(P<0.05)。转染重组腺病毒Ad-CMV-hTRAIL95-281的293T细胞在转染后24 h表达量最高(P<0.001),达到131.45 pg/ml,48 h时TRAIL蛋白表达量明显降低(P<0.01),72小时也有继续降低的趋势。结论重组腺病毒在适宜的MOI值下,在A549细胞中96小时内均有较高的转染效率,且重组腺病毒介导的可溶性hTRAIL基因在体外能够有效表达。

人NP9基因蛋白重组腺病毒的制备

目的:制备表达人NP9蛋白的复制缺陷型重组腺病毒。方法:酶切pMD18TNP9质粒获得NP9基因编码区序列并克隆至穿梭载体构建重组pAdTrackCMVNP9载体,线性化后与pAdEasy1共转化BJ5183,通过同源重组得到重组的pADNP9病毒载体。将重组腺病毒载体转染HEK293包装细胞制备重组腺病毒。结果:酶切鉴定得到阳性pADNP9重组腺病毒载体,该载体能有效转染HEK293细胞并在细胞内成功包装,转染3d后可以观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达并逐渐增多、增强。结论:成功构建了NP9基因的重组腺病毒载体并制备重组腺病毒颗粒,为进一步研究NP9基因的功能及应用NP9进行基因治疗奠定基础。

人IL-21基因重组复制缺陷型腺病毒对肿瘤细胞的初步抑瘤效应

IL-21在治疗自身免疫性疾病、变态反应性疾病和抗肿瘤中发挥重要作用，特别是在肿瘤的基因治疗方面被广泛研究，具有潜在的临床研究价值。本研究利用AdMax腺病毒包装系统制备含人IL-21基因的重组复制缺陷型腺病毒，观察腺病毒转染食管癌细胞EC-9706后对其生长的影响，为开展IL-2l基因在肿瘤治疗中的应用提供资料。

重组人肝细胞生长因子-NK4腺病毒的制备及初步鉴定

目的制备表达人肝细胞生长因子(HGF)-NK4蛋白的复制缺陷型重组腺病毒。方法酶切pcDNA3-hNK4质粒获得NK4基因编码区序列并克隆至穿梭载体构建重组pAdTrack-CMV-NK4载体,线性化后与pAdEasy-1共转化B J5183,通过同源重组得到重组pAd-NK4病毒载体。将重组腺病毒载体转染HEK293包装细胞制备重组腺病毒,用病毒悬液感染人肝癌细胞株HepG2。RT-PCR法检测感染肿瘤细胞中NK4 mRNA表达。结果酶切鉴定得到阳性pAd-NK4重组腺病毒载体,该载体能有效转染HEK293细胞并在细胞内成功包装。在转染2 d后能观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达。制备的Ad-NK4在体外能有效感染HepG2细胞并获得NK4基因高水平表达。结论成功构建了NK4基因的重组腺病毒载体并制备重组腺病毒颗粒,为进一步研究NK4基因的功能及应用NK4进行基因治疗提供实验依据。