弓形虫SAG1单基因疫苗与SAG1-ROP2复合基因疫苗的免疫效果观察

目的构建弓形虫主要表面抗原SAG1单价基因疫苗及其与棒状体蛋白ROP2的复合基因疫苗,接种BALB/c小鼠,观察疫苗的免疫保护性。方法构建重组质粒pcDNA3.1SAG1及pcDNA3.1SAG1ROP2。将两核酸疫苗分别免疫小鼠,ELISA法检测血清IgG抗体、IFNγ、IL4;流式细胞仪测定T细胞亚群;弓形虫速殖子腹腔攻击感染观察小鼠生存时间。结果获得pcDNA3.1SAG1、pcDNA3.1SAG1ROP2重组质粒;pcDNA3.1SAG1ROP2组小鼠IgG抗体(P<0.05)、IFNγ(P<0.01)及CD8+细胞比例(P<0.05)均高于pcDNA3.1SAG1组;实验组组均未测到IL4;复合基因组感染弓形虫后生存时间较单基因组延长(P<0.01)。结论弓形虫不同生活阶段的抗原基因复合疫苗较单基因疫苗具有更好的免疫保护性。

弓形虫复合基因疫苗pcSAG1-ROP5诱导小鼠免疫应答的研究

目的观察弓形虫复合基因疫苗pcSAGl-ROP5免疫小鼠后诱导的免疫应答。方法构建弓形虫重组真核表达质粒pcSAGl、pcROP5和pcSAGl-ROP5，分别通过PCR、酶切和测序鉴定后，转染人宫颈癌细胞（HeLa细胞），蛋白印迹（Westernblotting）分析重组蛋白的体外表达情况。70只昆明小鼠随机均分为5组（每组14只），分别为pc-SAGl组、pcROP5组、pcSAGl-ROP5组、空质粒组和空白对照组。重组质粒组每次每只肌注100μg重组质粒，每2周免疫1次，共3次。空质粒组和空白对照组分别注射等量的空质粒和PBS。于每次免疫前和末次免疫后2周眼眶采血。制备血清。采用ELISA法检测pcSAGl-ROP5组小鼠末次免疫后2周的血清与重组蛋白SAGl、ROP5和SAGl-ROP5结合的效价，以及5组小鼠的各次血清中抗弓形虫抗体IgG水平。末次免疫后3周，每组小鼠取10只腹腔接种10s弓形虫速殖子，观察生存时间。末次免疫后4周，采用ELISA法检测小鼠脾细胞培养上清中r干扰素（IFN-r）和白细胞介素4（IL-4）的水平。结果重组真核表达质粒构建成功。Westernblotting分析结果显示，重组质粒pcSAGl、pcROP5和pcSAGl-ROP5均能在HeLa细胞中表达，重组蛋白的相对分子质量（尬）分别为31000、57000和88000。pcSAGl-ROP5组小鼠血清与重组蛋白SAGl、ROP5和SAGl-ROP5结合的效价分别为1：320、1：160和1：2560。3个重组质粒组小鼠血清抗弓形虫IgG抗体水平随着免疫次数的增加和时间的延长逐渐升高，末次免疫后2周，pcSAGl-ROP5组小鼠血清IgG抗体水平（0．612±0．031）显著高于其他各组（P〈0．05）。攻击感染后，pcSAGl-ROP5组小鼠的平均存活时间为（288±7）h，较pc—SAGl组和pcROP5组分别延长了48h和96h（P〈0．05）。末次免疫后4周，pcSAGl-ROP5组小鼠脾细胞培养上清中IFN-1水平[（908．52±6．31）pg／m1]显著高于其他各组（P〈0．05），各组的IL-4水平差异无统计学意义（P〉0．05）。结论与弓形虫单基因疫苗pcSAGl和pcROP5相比，复合基因疫苗pcSAGl-ROP5所诱导的抗弓形虫IgG抗体和IFN-1水平较高，攻击感染后存活时间延长。

以HBc颗粒为呈现载体的HBV多表位复合基因真核表达载体的构建

目的 构建以HBVHBc颗粒为呈现载体的HBV多表位复合基因真核表达质粒 ,以探讨HBV基因免疫的新途径。方法 PCR扩增HBc第 1～ 72aa及 93～ 183aa编码序列并定向克隆至pcDNA3.1的NheⅠ /XhoⅠ位点 ,构建真核表达载体pHBcdM。合成HBV多表位基因并插入HBc原脊区基因位点 ,构建HBc Mep融合基因真核表达质粒。经PCR、酶切及序列测定等方法筛选阳性质粒。结果 双酶切及测序结果证实阳性质粒正确克隆了约 885bp、编码HBc与HBV多表位的复合基因。结论 成功构建了以HBc颗粒为呈现载体的HBV多表位复合基因真核表达载体pHBc Mep ,为研究pHBc Mep作为DNA疫苗的免疫活性奠定基础。

人工合成恶性疟原虫复合基因在大肠杆菌中的表达及产物的初步鉴定

将人工合成与构建的恶性疟原虫保护性抗原复合基因ＨＧＦＣ和ＨＧＦＣＡＣ分别与表达载体ｐＷＲ４５０－１重组并转化大肠杆菌ＪＭ１０９，工程菌经ＩＰＴＧ诱导后表达出含外源基因产物与β－半乳糖苷酶部分氨基酸的融合蛋白，分子量分别为６５ｋＤａ和７７ｋＤａ。免疫印迹分析显示表达产物可与兔抗恶性疟原虫ＲＥＳＡ多肽抗原的抗体发生特异性免疫反应，提示融合蛋白中含有恶性疟原虫抗原位点。

弓形虫SAG1、GRA2单基因疫苗及SAG1-GRA2复合基因疫苗的免疫效果观察

目的检测SAG1和GRA2基因编码的单基因及复合基因疫苗诱导小鼠的免疫应答,评价其抗弓形虫感染的保护性免疫效果。方法大量制备pcDNA3.1-SAG1、pcDNA3.1-GRA2、pcDNA3.1-SAG1-GRA2真核表达重组质粒,肌内注射BALB/c小鼠,分别于2周、4周后加强免疫一次。另设立pcDNA3.1及PBS对照组。于3次免疫后4周作免疫指标测定(包括ELISA法测定小鼠血清IgG抗体及细胞因子IFN-γ、IL-4,MTT法测定小鼠淋巴细胞增殖能力及NK细胞杀伤活性),并观察弓形虫速殖子攻击感染后小鼠的生存时间。结果SAG1-GRA2组小鼠血清IgG抗体、IFN-γ、淋巴细胞增殖能力及NK细胞杀伤活性均高于SAG1及GRA2组(P<0.05);各组均未检测到IL-4;复合基因组小鼠生存时间较单基因疫苗组延长(P<0.01)。结论弓形虫SAG1-GRA2复合基因疫苗较SAG1、GRA2单基因疫苗具有更好的免疫保护性。

恶性疟原虫疫苗研究Ⅳ──恶性疟原虫保护性抗原复合基因(PfCMR)的克隆与高效表达

将恶性疟原虫保护性抗原复合基因（PfCMR）与表达质粒pWR450—1分别经BamHI、EcoRI双酶切后回收、纯化和重组并转化大肠杆菌JM109，再经含氨苄青霉素LB培基初筛后，挑白色菌落扩增，用PCR复筛和双酶切鉴定，阳性克隆子pWR450—1—B14用IPTG诱导，在JM109中表达。表达产物经SDS—PAGE分析，在65kDa处出现较宽的蛋白条带。用SOS显色法证实此表达蛋白具有β-半乳糖苷酶活性。表达的融合蛋白与抗恶性疟原虫多克隆免疫血清特异结合．其滴度高达1：3200；Westernblot分析显示，表达蛋白能与特异性抗体产生较强的免疫反应。上述结果提示表达的融合蛋白具有生物学和免疫学活性。

Tim-3启动子区-1541 C>T、-882 T>C、-574 G>T各复合基因型与尘螨变应性鼻炎的研究

目的Tim-3启动子区-1541 C>T、-882 T>C、-574 G>T各复合基因型与尘螨变应性鼻炎的关系。方法运用PCR-RFLP、PCR-ARMS检测88例尘螨变应性鼻炎及102例正常人Tim-3启动子区-1541 C>T、-882 T>C、-574 G>T基因多态性。结果尘螨变应性鼻炎组Tim-3-1541CC/-882CC/-574G,-1541CC/-882CC/-574GT+TT,-1541CC/-882TC+TT/-574GG,-1541CT+TT/-882CC/-574GG及其他复合基因分别为:0.8409、0.1136、0.027、0.027和0,对照组分别为,0.7941、0.0784、0.0196、0.0868和0。结论广东汉族人群Tim-3启动子区-1541 C>T、-882 T>C、-574 G>T各复合基因型与尘螨变应性鼻炎无相关联。

HBc与HBV多表位复合基因在肝癌细胞中的转染与表达

目的观察HBc与HBV多表位复合基因在肝癌细胞株nepG2细胞内表达情况。方法将构建的HBc与HBV多表位复合基因真核表达质粒pHBcMep以Lipofectamine介导转染HepG2细胞,通过间接免疫荧光、Western-blot检测表达产物。结果经G418筛选的阳性转染细胞经间接免疫荧光染色后在紫外光激发时发出明显的荧光,而未转染质粒或转染pcDNA3.1的HepG2细胞则无明显荧光。Western-hot结果显示表达产物约为33kDa,并能与抗preS2多抗特异性结合。结论HBc与HBV多表位复合基因在肝癌细胞内获得正确表达。

荧光标记检测STR复合基因座的应用

自DNA检验应用于法医鉴定以来,经过了十几年的发展,已建立了许多各种各样的方法和技术.STR分析方法虽发展时间不长,但由于其本身特有的特点,如等位基因片段短小,易于扩增,灵敏度高;基因座多,识别力强;对降解DNA能进行分析,可检验腐败陈旧生物检材;易于实现自动分析和计算机管理等,已日益成为日常DNA分析的主要、首选方法.STR分析从单个位点扩增分析到多个位点复合扩增分析,从银染到荧光检测分析,日趋自动化.反过来,检验程序的自动化进一步促进STR技术在日常案件检验中的应用.现荧光标记检测STR复合基因座技术已开始在法医DNA检验中应用并将被广泛采用.本文就其应用中的一些问题进行讨论.

复合基因在骨缺损基因治疗中的研究进展

骨缺损愈合是一个涉及多种细胞因子的增殖，分化和细胞外基质的合成与钙化等复杂的过程，目前认为参与骨折愈合的重要细胞因子有：骨形态发生蛋白（BMP）、血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、转化生长因子-β（TGF-β）、胰岛素样生长因子（IGFs）、血小板衍生生长因子（PDGF）、神经生长因子（NGF）、骨衍生生长因子（BDGF），其他一些来自血细胞的衍生因子如白细胞溶菌素、肿瘤坏死因子（TNF）、淋巴细胞毒素、干扰素等也参与骨折的愈合。

弓形虫单基因和复合基因疫苗的研究进展

弓形虫（Toxoplasma gondii）为专性细胞内寄生原虫,全球分布,能引起人兽共患寄生虫病,全世界的感染率为34%,大多数为隐性感染,孕妇感染常引起流产、畸胎、死胎,对于肿瘤患者或AIDS病人等免疫功能受损者,弓形虫是引起死亡的主要原因之一。

HBV多表位复合基因在NS-1细胞的表达

目的 研究HBc颗粒为呈现载体的HBV多表位复合基因在哺乳动物细胞NS - 1内的表达。方法 PCR扩增HBc 1～ 72aa及 93～ 1 83aa编码序列并合成HBV多表位复合基因 ,定向克隆至pcDNA3 .1 (+)。经双酶切及核苷酸序列测定等方法筛选阳性克隆。阳性质粒以Lipofectamine介导转染NS - 1细胞 ,通过ELISA及间接免疫荧光等方法检测细胞表达产物。结果 双酶切及测序结果证实阳性质粒正确克隆了约 890bp的HBc与HBV多表位复合基因的杂合基因。重组子成功转染NS - 1细胞并表达HBc-Mep融合蛋白。 结论 HBc颗粒为呈现载体的HBV多表位复合基因在哺乳动物细胞NS - 1内正确表达目的蛋白。为研究pHBc -Mep作为DNA疫苗的免疫活性奠定基础。

弓形虫p30-Rop2复合基因大肠杆菌／分枝杆菌穿梭质粒的构建

目的：构建弓形虫p30—Rop2复合基因大肠杆菌／分枝杆菌穿梭表达质粒。方法：利用PCR技术从已构建的pET30-p30-Rop2质粒扩增p30-Rop2复合基因片段，亚克隆于大肠杆菌／分枝杆菌穿梭质粒pSTM3，构建重组质粒pSTM3-p30-Rop2，并进行双酶切鉴定和测序分析。结果：成功构建pSTM3-p30-Rop2重组穿梭表达载体，测序结果发现有一个碱基发生突变，但没有改变开放阅读框。结论：pSTM3-p30—Rop2穿梭质粒的成功构建为弓形虫分枝杆菌疫苗的研制提供了前提条件。

FcγRⅡA-R131-FcγRⅢB-NA2复合基因型与汉族人群慢性牙周炎关系的研究

目的探讨FcγRⅡA-R131-FcγRⅢB-NA2复合基因型与慢性牙周炎敏感性的关系。方法收集63例重度慢性牙周炎(CP)患者、103例轻中度慢性牙周炎患者及80名健康对照者的颊粘膜拭子,提取DNA,采用序列特异性引物PCR(PCR-SSP)法及等位基因特异性引物PCR(PASA)法测定FcγRⅡA和FcγRⅢB的基因多态性,比较FcγRⅡA-R131-FcγRⅢB-NA2复合基因型在各组间分布的差异。结果FcγRⅡA-R131-FcγRⅢB-NA2复合基因型在重度CP组与健康对照组之间的分布有显著性差异(P<0.0125),而在轻中度CP组与对照组、重度CP组与轻中度CP组之间分布无显著性差异(P>0.0125)。结论FcγRⅡA-R131-FcγRⅢB-NA2复合基因型与慢性牙周炎的严重程度相关,提示其可能与汉族人群慢性牙周炎的敏感性相关。

大肠埃希菌肠毒素B亚基对弓形虫速殖子SAG1-ROP2复合基因免疫效果的影响

目的研究大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚基(LTB)对弓形虫速殖子SAG1-ROP2复合基因免疫效果的影响。方法构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-SAG1-ROP2和pEASY-E1-LTB。BALB/c小鼠88只,随机均分为4组,分别用PBS(A组)、pcDNA3.1空质粒(B组)、pcDNA3.1-SAG1-ROP2质粒(C组),以及pcDNA3.1-SAG1-ROP2质粒和pEASY-E1-LTB质粒(D组)进行滴鼻免疫,每种质粒20μg/(只·次)。每组小鼠随机抽取15只,每周免疫1次,共4次,末次免疫后2周,测定其血清IgG和IgA抗体水平,气管和小肠黏膜冲洗液分泌型IgA(sIgA)水平,以及脾细胞培养上清中γ干扰素(IFN-γ)和白细胞介素4(IL-4)水平;每组中余7只小鼠,每周免疫1次,共3次,末次免疫后4周,弓形虫速殖子腹腔接种感染(1×103/鼠),观察比较各组生存时间。结果成功构建pEASY-E1-LTB重组表达质粒。D组小鼠血清IgG(0.626±0.100)和IgA抗体水平(1.086±0.138),气管和小肠黏膜冲洗液sIgA水平(0.886±0.164),以及细胞因子IFN-γ[(2017±266)pg/ml]和IL-4水平[(203±31)pg/ml]均显著高于其他各组(均P<0.05)。感染弓形虫速殖子后,A、B、C和D组小鼠的生存时间中位数分别为3、4、6和10d,D组的生存时间长于其他各组(均P<0.05)。结论LTB能明显增强弓形虫速殖子SAG1-ROP2复合基因的免疫效果。

猪血液免疫性状的复合基因组选择研究

该研究在提出"复合基因组选择(composite genomic selection)"概念的基础上,利用华中农业大学农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室构建的免疫资源群体数据,通过交叉验证(cross-validation)策略,与标准GBLUP法对照,利用白细胞(WBC)、噬中性粒细胞(NE)等13项血液免疫性状对复合基因组选择的预测效果开展验证。研究结果表明,除血小板(PLT)等3个性状外,所有性状复合基因组选择的准确性均高于标准GBLUP法,分析结果支持复合基因组选择优于基于单一加性遗传组分的GBLUP的结论。同时,还探讨了不同交叉验证参数组合对复合基因组选择准确性的影响,发现最宜交叉验证倍数是性状特异性的,跟性状特性有关。总之,该研究提出了基于全部遗传组分的复合基因组选择法,并得到猪血液免疫性状数据分析结果的初步支持,特别是针对较小规模群体,复合基因组选择可能是提高基因组预测准确性的有效方法。

复合基因载体可安全高效传导大鼠骨髓间充质干细胞

目的探讨精胺普鲁兰多糖多聚体(SP)与腺病毒载体(Adv)形成的复合基因载体(SP-Adv)对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的传导效率及其安全性。方法 SP与腺病毒载体(Adv)室温混合孵育15 min形成SP-Adv;透射电镜观察SP-Adv的物理化学性质;双萤光素酶报告系统检测SP-Adv在MSCs中的传导效率;MTT实验评价SP-Adv的细胞毒性;碱性磷酸酶染色和油红O染色检测SP-Adv对MSCs成骨及成脂分化能力的影响。结果 SP-Adv粒径变大且原病毒纤突消失被水合层代替;SP-Adv对MSCs的基因传导效率显著高于未包裹的Adv(P<0.001),且SPAdv对MSCs无明显的细胞毒性;MSCs的成骨细胞和成脂细胞分化实验证实SP-Adv对MSCs的分化能力无影响。结论 SP-Adv可以对MSCs进行高效的基因传导,且证实该传导在细胞水平具有安全性。

民族文化认同“复合基因”的内涵成因及当代教育传承策略——以大理白族为个案

民族文化认同"复合基因"是社会成员的一种思维方式或心理特质,表现为既主动学习主流文化以提升自我,又能坚守自我文化之个性,进而实现民族文化发展的辩证统一。以大理白族为例,文化认同"复合基因"积极促成了其文化发展的自觉,其形成与开放包容的自然人文环境和多元互补的教育结构不无关系,且其绵延生长离不开具有丰富内容的"文化心理场"为基础。以史为鉴,当前民族文化认同"复合基因"传承须要采取共谐互补的学校教育与校外"文化心理场"关系;"空间景点+时间民俗"的传统文化保护体系;"以人为本"的教育评价取向;分合位育的学校、家庭和社会教育结构统一等策略来实现。

培育文化认同“复合基因”的意义、条件及路径

文化认同"复合基因"是社会成员的心理特质,包含"内隐"与"外显"两个层面的统一,是民族文化继承和创新发展的重要基础。文化认同"复合基因"的培育离不开结构优化的"文化心理场""全面性和全员性"的文化教育体系、化育成俗的社会主义核心价值观风气等人文环境条件。通过以人为中心,实现家庭、学校及社会教育的互动整合;以创新为取向,构建"互联网+文化"的认知平台;以交往为纽带,激活民间"自组织"的文化再生功能;以"宣入教",强化基层政府的文化治理能力等路径方法来加以保障。

弓形虫表面抗原P30、P22与霍乱毒素A_2/B复合基因真核表达质粒的构建

目的选择弓形虫 RH 株主要表面抗原 P30、P22的有效基因片段和霍乱毒素 A_2/B 亚基共同构建在同一真核表达载体 pcDNA3.1(-)上,并保证其连接方向和开放读码框的正确。方法用PCR 技术分别从弓形虫 RH 株基因组 DNA 和 pUAB024-CTXA_2/B 质粒中扩增编码 P30、P22基因片段和 CTXA_2/B,定向重组入 pUC18克隆载体,然后酶切释放 P30-P22-CTXA_2/B 复合基因片段,亚克隆入pcDNA3.1(-)真核表达载体,再经含氨苄青霉素的 LB 培养基筛选、酶切及测序鉴定。结果酶切产物经电泳显示条带清晰,P30、P22和 CTXA_2/B 基因片段的泳动位置分别在786bp、492bp、512bp 的位置,与预计结果一致;测序结果表明插入的基因片段方向及序列均正确。结论成功地构建了真核表达重组质粒 pcDNA3.1-P30-P22-CTXA_2/B,保证了三个基因连接方向,序列及开放读码框的正确,为下一步融合蛋白 P30-P22-CTXA_2/B 在哺乳动物细胞中的表达及动物实验奠定了基础。