弓形虫复合基因疫苗pcSAG1-ROP5诱导小鼠免疫应答的研究

目的观察弓形虫复合基因疫苗pcSAGl-ROP5免疫小鼠后诱导的免疫应答。方法构建弓形虫重组真核表达质粒pcSAGl、pcROP5和pcSAGl-ROP5，分别通过PCR、酶切和测序鉴定后，转染人宫颈癌细胞（HeLa细胞），蛋白印迹（Westernblotting）分析重组蛋白的体外表达情况。70只昆明小鼠随机均分为5组（每组14只），分别为pc-SAGl组、pcROP5组、pcSAGl-ROP5组、空质粒组和空白对照组。重组质粒组每次每只肌注100μg重组质粒，每2周免疫1次，共3次。空质粒组和空白对照组分别注射等量的空质粒和PBS。于每次免疫前和末次免疫后2周眼眶采血。制备血清。采用ELISA法检测pcSAGl-ROP5组小鼠末次免疫后2周的血清与重组蛋白SAGl、ROP5和SAGl-ROP5结合的效价，以及5组小鼠的各次血清中抗弓形虫抗体IgG水平。末次免疫后3周，每组小鼠取10只腹腔接种10s弓形虫速殖子，观察生存时间。末次免疫后4周，采用ELISA法检测小鼠脾细胞培养上清中r干扰素（IFN-r）和白细胞介素4（IL-4）的水平。结果重组真核表达质粒构建成功。Westernblotting分析结果显示，重组质粒pcSAGl、pcROP5和pcSAGl-ROP5均能在HeLa细胞中表达，重组蛋白的相对分子质量（尬）分别为31000、57000和88000。pcSAGl-ROP5组小鼠血清与重组蛋白SAGl、ROP5和SAGl-ROP5结合的效价分别为1：320、1：160和1：2560。3个重组质粒组小鼠血清抗弓形虫IgG抗体水平随着免疫次数的增加和时间的延长逐渐升高，末次免疫后2周，pcSAGl-ROP5组小鼠血清IgG抗体水平（0．612±0．031）显著高于其他各组（P〈0．05）。攻击感染后，pcSAGl-ROP5组小鼠的平均存活时间为（288±7）h，较pc—SAGl组和pcROP5组分别延长了48h和96h（P〈0．05）。末次免疫后4周，pcSAGl-ROP5组小鼠脾细胞培养上清中IFN-1水平[（908．52±6．31）pg／m1]显著高于其他各组（P〈0．05），各组的IL-4水平差异无统计学意义（P〉0．05）。结论与弓形虫单基因疫苗pcSAGl和pcROP5相比，复合基因疫苗pcSAGl-ROP5所诱导的抗弓形虫IgG抗体和IFN-1水平较高，攻击感染后存活时间延长。

大肠埃希菌肠毒素B亚基对弓形虫速殖子SAG1-ROP2复合基因免疫效果的影响

目的研究大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚基(LTB)对弓形虫速殖子SAG1-ROP2复合基因免疫效果的影响。方法构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-SAG1-ROP2和pEASY-E1-LTB。BALB/c小鼠88只,随机均分为4组,分别用PBS(A组)、pcDNA3.1空质粒(B组)、pcDNA3.1-SAG1-ROP2质粒(C组),以及pcDNA3.1-SAG1-ROP2质粒和pEASY-E1-LTB质粒(D组)进行滴鼻免疫,每种质粒20μg/(只·次)。每组小鼠随机抽取15只,每周免疫1次,共4次,末次免疫后2周,测定其血清IgG和IgA抗体水平,气管和小肠黏膜冲洗液分泌型IgA(sIgA)水平,以及脾细胞培养上清中γ干扰素(IFN-γ)和白细胞介素4(IL-4)水平;每组中余7只小鼠,每周免疫1次,共3次,末次免疫后4周,弓形虫速殖子腹腔接种感染(1×103/鼠),观察比较各组生存时间。结果成功构建pEASY-E1-LTB重组表达质粒。D组小鼠血清IgG(0.626±0.100)和IgA抗体水平(1.086±0.138),气管和小肠黏膜冲洗液sIgA水平(0.886±0.164),以及细胞因子IFN-γ[(2017±266)pg/ml]和IL-4水平[(203±31)pg/ml]均显著高于其他各组(均P<0.05)。感染弓形虫速殖子后,A、B、C和D组小鼠的生存时间中位数分别为3、4、6和10d,D组的生存时间长于其他各组(均P<0.05)。结论LTB能明显增强弓形虫速殖子SAG1-ROP2复合基因的免疫效果。