膜蛋白三维结构研究的新突破——线粒体呼吸链膜蛋白复合物Ⅱ结构解析

由清华大学-中科院生物物理所结构生物学联合研究小组完成的“线粒体呼吸链膜蛋白复合物II的晶体结构”研究成果以Article的方式发表在2005年7月1日出版的Cell上。本文介绍了该项成果的研究背景、意义、主要创新点及方法。

主要组织相容性复合物Ⅱ对Graves病发病影响的研究

目的应用主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ与人TSH受体(TSHR)共表达细胞(hM12细胞)模拟Graves病(GD)时的甲状腺细胞,免疫C57BL/6小鼠,诱导GD动物模型,以研究异常表达于GD患者甲状腺滤泡上皮细胞上的MHC-Ⅱ分子是否是GD的致病因素。方法试验组C57BL/6小鼠8只,用hM12细胞进行腹腔免疫,每2周1次,共6次,对照组C57BL/6小鼠5只,用M12细胞免疫,方法同试验组。受试小鼠末次免疫5周后,检测以下指标:甲状腺激素水平;甲状腺刺激性抗体(TSAb);甲状腺组织学检查。结果C57BL/6小鼠试验组2/8小鼠诱导为Graves甲亢。C57BL/6小鼠的T细胞(MHC-Ⅱ为H-2b)不能识别由hM12细胞(H-2d)提呈的抗原,C57BL/6小鼠出现GD样变化可能是hM12细胞表达的TSHR被小鼠体内职业性抗原递呈细胞(APCs)获取,经加工处理提呈给T细胞,诱发自身免疫反应的结果。结论异常表达于GD患者甲状腺滤泡上皮细胞上的MHC-Ⅱ分子可能与GD的发病无关,而是一种自身免疫反应的继发现象。

黑质小胶质细胞主要组织相容性复合物Ⅱ的表达与帕金森病发生和进展的关系

近年来诸多证据显示,中枢神经统的免疫异常和炎症反应参与了黑质多巴胺能神经元的变性坏死。小胶质细胞的激活是脑内炎症反应的主要标志,小胶质细胞主要组织相容性复合物Ⅱ(MHCⅡ)的表达是小胶质细胞活化的标志。尽管人脑中的小胶质细胞并不持续表达MHCⅡ类分子,但随着年老以及在中枢神经系统出现病变的情况下(包括神经变性),它们的表达确是明显上调的。研究发现,在PD病人和PD动物模型的中脑黑质均可发现大量MHCⅡ阳性的小胶质细胞,MHCⅡ类分子在小胶质细胞将外源性抗原呈递给CD4+Th细胞的过程中起重要作用。在6-羟多巴胺(6-OHDA)、脂多糖(LPS)大鼠模型的观察发现,促红细胞生成素、地塞米松等能明显降低MHCⅡ的表达和小胶质细胞的活化,从而减轻动物模型的临床症状。鉴于MHCⅡ抗原启动的免疫反应在PD的发病过程中有促进慢性神经变性进展的作用,因此,抑制小胶质细胞活性和MHCⅡ表达对控制PD进展可能有重要的治疗上的意义。

复合物Ⅱ抑制剂的作用机制和研究进展

复合物Ⅱ是线粒体电子传递链上重要功能复合物,已经成为农用杀菌剂方面的关键靶标。该类杀菌剂在植物病原真菌保护中发挥着重要的作用。本文在综述复合物Ⅱ结构和泛醌结合位点作用机制的基础上,总结了复合物Ⅱ抑制剂的类型和结构特征,介绍了最新的研究进展,旨在为开发新的复合物Ⅱ抑制剂提供思路。

骨癌痛大鼠脊髓背根神经节主要组织相容复合物Ⅱ表达变化的研究

目的：建立大鼠胫骨的骨癌痛模型，观察骨癌痛发生时脊髓背根神经节内主要组织相容复合物Ⅱ（MHCⅡ）的表达变化情况。方法雌性SD大鼠33只，随机分为正常组（Naive组，n=9）、假手术组（Sham组，n=12）和骨癌痛组（骨癌痛组，n=12）。骨癌痛组右侧胫骨的骨髓腔内接种Walker 256乳腺癌细胞，Sham组注射相等体积的D- Hanks液。于手术前1天及手术后3、7、10和14 d使用von- Frey丝测定手术侧的机械缩爪阈值；于手术后14 d采集各组（n=9）的L3～L5的右侧背根神经节，每3只大鼠的背根神经节标本作为一组提取总的蛋白质，采用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测MHCⅡ的变化情况；于手术后14 d多聚甲醛灌注Sham组（n=3）和骨癌痛组（n=3）大鼠，取L3～L5的右侧背根神经节制作冷冻切片，采用免疫荧光双标染色观察MHCⅡ的变化情况以及与神经元和卫星细胞的关系。结果手术前各组大鼠的机械缩爪阈值，差异无统计学意义；骨癌痛组在骨癌痛模型建立7 d后较基础值显著降低，差异有统计学意义（P〈0.05），且显著低于Naive组，差异有统计学意义（P〈0.05）。免疫荧光染色显示MHCⅡ表达于背根神经节的卫星细胞；同时Western blot定量结果发现骨癌痛组的MHCⅡ表达水平显著高于Naive组，而Sham组变化差异无统计学意义。结论骨癌痛大鼠背根神经节的MHCⅡ表达升高，可能参与骨癌痛的外周敏化。

热激诱导Jurkat细胞中主要组织相容性复合物Ⅱ类转录激活因子基因和人白细胞抗原的表达

目的检测热激对Jurkat细胞中主要组织相容性复合物Ⅱ类转录激活因子(CⅡTA)的表达,及其对下游人类白细胞抗原(HLA-DR)表达的影响。方法采用实时RT-PCR检测42℃热激和干扰素-γ(IFN-γ)作用前后Jurkat细胞中CⅡTA mRNA的变化。采用Western blot检测热激和IFN-γ作用前后Jurkat细胞中CⅡTA蛋白的表达变化。采用流式细胞仪荧光分析热激前后Jurkat细胞表面HLA-DR的表达。结果在Jurkat细胞中,热激可诱导CⅡTAmRNA和蛋白的表达,而IFN-γ处理后无明显变化。与正常Jurkat细胞相比,热激后HLA-DR在Jurkat细胞表面的抗原浓度明显增加(P<0.01)。结论热诱导Jurkat细胞中CⅡTA和HLA-DR先后表达增高。提示热激可能在免疫基因表达缺陷的细胞中,重建相关基因的功能,为肿瘤热疗提供新的依据。

酿酒酵母中基于外壳蛋白复合物Ⅱ囊泡的蛋白分泌调控机制的研究进展

在酿酒酵母中,外壳蛋白复合物Ⅱ(COPⅡ)包裹的囊泡是蛋白质从内质网转运至高尔基体的媒介,其中COPⅡ囊泡介导的运输是蛋白分泌途径中至关重要的一步。COPⅡ囊泡的运输包括囊泡形成、出芽、束缚和融合。整个过程需要外壳蛋白亚基、三磷酸鸟苷(GTP)、束缚因子等多种组分的参与,且部分组分之间存在的相互作用确保了蛋白质的正确运输。研究对COPⅡ囊泡整个运输过程中受到的外壳亚基组装、蛋白质捕获以及膜融合等一系列调控机制进行较系统综述,有望为改造酿酒酵母中蛋白分泌途径提供参考。

线粒体呼吸链复合物Ⅱ缺陷所致Leigh综合征

线粒体呼吸链复合物Ⅱ缺陷是较为少见的氧化磷酸化障碍性疾病。本文对1例单纯线粒体呼吸链复合物Ⅱ缺陷所致Leigh综合征患儿的诊疗进行回顾性分析。患儿,男,10个月,8个月时出现发热,热退后出现进行性全身无力、运动发育倒退和吞咽困难。血乳酸、丙酮酸增高,脑MRI显示双侧基底节对称性损害。对患儿进行了外周血白细胞线粒体氧化磷酸化酶复合物I-V活性测定和线粒体基因突变位点筛查分析。线粒体呼吸链复合物Ⅱ活性为21.9 nmol/min.mg线粒体总蛋白(正常对照47.3±5.3 nmol/min.mg线粒体总蛋白),柠檬酸合酶活性为22.1%(正常对照50.9%±10.7%),均显著降低。线粒体基因分析未发现异常。患儿确诊为线粒体呼吸链复合物Ⅱ缺陷所致Leigh综合征。经治疗患儿运动功能明显恢复。目前患儿22个月,病情稳定。

线粒体呼吸链复合物Ⅱ缺陷与疾病

本文就近年关于线粒体呼吸链复合物Ⅱ的结构、功能及其缺陷的临床表型、诊断、治疗及分子遗传学研究方面的进展进行文献综述。线粒体呼吸链复合物Ⅱ亦称琥珀酸泛醌氧化还原酶,是线粒体呼吸链的重要组分之一,对细胞的氧化磷酸化起着关键作用。呼吸链复合物Ⅱ与氧化性应激密切相关,是细胞内毒性物质以及异常代谢产物的敏感靶标。复合物Ⅱ缺陷导致的线粒体病临床表现多样,以神经肌肉进行性损害为主要表现,少数表现为心肌病、发作性呕吐、溶血尿毒综合征等。诊断有赖于线粒体呼吸链酶复合物活性测定和基因分析。患者受累组织的呼吸链复合物Ⅱ活性降低。已发现SDHA基因与编码复合物Ⅱ组装因子的SDHAF1基因的突变可导致复合物Ⅱ缺陷。目前线粒体呼吸链复合物Ⅱ缺陷的治疗主要是以改善线粒体功能为主。

PSⅡ-LHCⅡ超分子复合物的结构与功能

PSⅡ-LHCⅡ超分子复合物是构成PSⅡ颗粒的基本单元,由PSⅡ核心复合物和LHCⅡ复合物构成。现介绍了超分子复合物的组装,PSⅡ核心复合物和LHCⅡ复合物的结构与功能,以及大量LHCⅡ和微量LHCⅡ在超分子复合物组装中的作用。

捕光复合物LHCⅡ的荧光动力学特性

采用时间分辨荧光光谱技术 ,在 2 73K下用波长为 5 0 7nm的光激发对菠菜光系统Ⅱ捕光天线LHCⅡ的光谱特性和时间特性作了研究 将获得的荧光光谱进行高斯解析 ,得到 6个光谱组分 ,反映了光谱特性 :Chla6 6 26 6 0 /6 6 1、Chla/b6 726 70 /6 71、Chla6 83 56 80 /6 81和Chla6 99 96 95 0 ,而中心波长为 738.6nm、76 1.0nm的光谱组分则可能对应着主发射峰的振动副带 通过对荧光衰减曲线进行三指数时间拟合 ,得到激发能在LHCⅡ中传递的时间常数 :8.8ps、5 0 0ps、1.6ns 。

大叶藻(Zostera marina L.)PSⅠ和PSⅡ复合物的分离鉴定

采用蔗糖密度梯度离心法分离纯化大叶藻类囊体膜 ,经 1 0 %SDS增溶后 ,用蔗糖密度梯度超速离心分离其色素蛋白质复合物。经稳态光谱分析、DCIP光还原活性测定及P680 、P70 0 差示光谱检测结果表明 ,2 0 %蔗糖层的CP3和 40 %蔗糖层 (上 )的CP4为PSⅡ复合物 ,具有光化学活性 ;40 %蔗糖层 (下 )的CP5为PSⅠ复合物 ,其P70 0 特征吸收峰位于 695nm处。CP3和CP4的DCIP光还原活性 :CP3为 34.2 7微电子当量 /(mgchl·h) ,CP4为 7.2 9微电子当量 /(mgchl·h)。

83 K光系统Ⅱ核心复合物不同激发的荧光光谱学

在83K低温下,利用稳态荧光光谱技术对光系统Ⅱ(PSⅡ)核心复合物中激发能的传递进行了研究,激励波长分别选择为436nm,480nm,495nm和507nm,得到4种波长激发下的稳态荧光光谱.经过比较发现其最大峰值所在的位置没有因激发波长的不同而发生改变,都在696nm处,在不同激发波长下经过高斯解析获得不同的谱带.根据发射光谱与吸收光谱的对应性,反映了不同的光谱特性,说明在不同波长光的激发下,核心复合物中能量传递的途径不同.同时,可以分析出在核心复合物中,至少有Chla667700.4,Chla668834.7,685.1,Chla668879.0,Chla669900.9,693.4,695.2,698.04种Chla组分参与了能量的传递.

PSⅡ核心复合物能量传递的飞秒时间分辨荧光光谱学研究

运用稳态、瞬态荧光光谱技术对光系统Ⅱ核心复合物的能量传递动力学进行研究。分别用436 nm光脉冲激发叶绿素a分子、451 nm光激发叶绿素a和β-胡萝卜素分子、473和481 nm光激发β-胡萝卜素分子,得到5组反应能量传递、电荷重组等过程的寿命组分:8～40 ps为核心天线中β-胡萝卜素分子通过相邻β-胡萝卜素分子或中间叶绿素a向叶绿素a分子传递能量的时间;85～152 ps为核心天线色素分子激发能传递时间;201～925 ps反映部分电荷重组过程;1.031～1.21 ns为参与能量传递的色素分子从激发态衰退回到基态的时间;6.17～18.13 ns的长寿命时间组分归因于P680+Pheo-的重组过程。将荧光发射谱进行高斯解析,发现在核心复合物中还至少存在Chla683685、Chla680682、Chla673,677679三种特征叶绿素a分子。

通心络胶囊对冠心病人血小板GPⅡb/Ⅲa复合物活性影响的临床研究

目的:观察通心络胶囊(人参,水蛭,全蝎等)口服对冠心病之不稳定心绞痛或急性心肌梗塞后病人血小板GPⅡb/ Ⅲa复合物活性的影响。方法:病人随机分为常规治疗组与通心络治疗组,应用流式细胞仪检测治疗前后CD43,CD62p, CD63等活性变化。结果:2周通心络治疗后通心络组病例血小板GPⅡb/Ⅲa复合物活性有统计学意义的降低,但较柔 和。结论:通心络具有较温和的抑制GPⅡb/Ⅲa复合物活性的作用,可认为是用于冠心病长期治疗较好的中药制剂。

弱光和Tris处理条件下PSⅡ放氧核心复合物的损伤

弱光条件下 (12 0 μmol·m- 2 ·s- 1)用Tris (0 .8mol/L ,pH 6 .5～ 10 .0 )处理具有放氧活性的PSⅡ核心复合物 ,可引起 33kD锰稳定蛋白的释放和锰复合物的破坏 ,并导致核心复合物的结构发生明显的改变 .温和电泳、SDS PAGE和双向电泳分析表明 ,主要是PSⅡ核心复合物的二聚体和单体减少 ,并且复合物部分解体 ;除反应中心D1和D2 蛋白外 ,核心天线CP4 3和CP4 7的量也减少 ,33kD锰稳定蛋白要发生降解 .避光时 。

维生素C保护Aβ_(1-40)Cu(Ⅱ)复合物引起的神经元氧化损伤

老年斑中存在大量β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)是老年痴呆症(Alzheimer′sdisease,AD)的重要病理特征.大量数据表明,Aβ上具有与过渡态金属离子共价结合的位点,二者能结合成为寡聚复合物.Aβ1-40Cu(Ⅱ)复合物通过Cu2+的还原催化O2产生H2O2,但反应机制不清.本文尝试以天然抗氧化剂维生素C(VC)来对抗Aβ1-40及Aβ1-40Cu(Ⅱ)复合物产生的H2O2对原代培养的神经细胞的毒性.结果表明,VC能够起到显著的保护作用,其有效浓度为1mmol/L.本文用胞外乳酸脱氢酶泄漏量和H2O2生成量的数据证实了细胞存活率(MTT实验)的实验结果.这些结果表明,Aβ1-40Cu(Ⅱ)复合物能够释放更多的H2O2,引发细胞膜破裂并最终引起细胞死亡.加入VC后,神经元受到的损伤较轻,提示VC在保护细胞免受氧化损伤方面发挥了重要作用.

绿色荧光蛋白(GFP)融合于人整合蛋白α_(Ⅱb)C端不影响α_(Ⅱb) β_3复合物在CHO细胞正常表达

本研究选择αⅡb作为靶蛋白观察绿色荧光蛋白(GFP)标记对αⅡbβ,复合物生物合成过程和表达的影响。 从人αⅡb表达载体p3.1-2b中经PCR扩增的αⅡb基因全长cDNA,插入表达载体pEGFP-N1中构建αⅡbGFP融合蛋 白表达载体,测序正确后利用脂质体将重组质粒与表达人整合蛋白β3亚基的真核表达质粒p3.1-3a共转染CHO 细胞,对转染后细胞用Western blot方法鉴定αⅡbGFP基因在CHO细胞中的表达并用激光共聚焦显微镜确定融合 蛋白的细胞内定位。结果表明:经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒, Western blot证明转基因CHO细胞有人αⅡbGFP基因的表达,融合蛋白细胞内定位研究显示αⅡbGFP可以由内质网 转运至高尔基体。结论:成功构建了人αⅡbGFP融合蛋白真核表达载体;GFP融合于αⅡbC端不影响αⅡbβ3复合物 在CHO细胞的正常表达。

急诊介入治疗前后AMI患者P选择素和血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa复合物表达研究

目的观察急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)患者急诊经皮冠状动脉介入治疗(简称介入治疗)前后血小板活化指标P选择素和血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa复合物表达的变化,探讨介入治疗对AMI患者血小板活化的影响。方法选取疑似冠心病且冠脉造影正常的21例患者为对照组,行急诊介入治疗的AMI患者24例(AMI组),应用流式细胞技术检测对照组及AMI组患者行介入治疗前后的P选择素和血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa复合物表达率。结果与对照组比较,AMI组患者P选择素和血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa复合物表达率均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);介入治疗后3dAMI组患者P选择素和血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa复合物表达率较术前下降,但与对照组比较仍有较高水平表达,差异有统计学意义(P均<0.05)。结论AMI患者急诊介入治疗前后体内血小板均处于高度活化状态,AMI患者术后抗血小板聚集治疗极其重要。

PSⅡ颗粒复合物飞秒分辨低温荧光动力学研究

采用飞秒时间分辨荧光光谱学对PSⅡ颗粒复合物在 83K ,16 0K ,2 73K下进行研究 ,实验表明随温度升高 ,光谱加宽 并且发现在PSⅡ颗粒复合物中至少存在以下几种特征Chl分子 :Chlb6 406 39,Chlb6 456 40 ,Chla6 6 36 6 0 ,Chla6 6 86 6 7,Chla6 76 6 73,Chla6 816 80 ,Chla6 826 80 /6 81,Chla6 88/6 896 84 ,6 85,Chla6 986 88 在不同的温度下 ,参与能量传递的色素分子传能途径各不相同 ,但都有一个共同点 :在到达反应中心之前能量传递高效进行 ,绝大多数能量传递到了反应中心 ,而在 6 80nm之后的波段 ,能量损耗明显增大 ,这是由于电子传能受阻 ,能量绝大多数以荧光形式耗散 对荧光衰减曲线进行时间拟合 ,得到四组时间常数 :30～ 4 0ps ,2 6 0ps ,5 5 0～ 6 70ps ,1～ 8ns 几个ns的长寿命组分 ,反映了两个能量传递过程 ,即与基对态P6 80 + pheo- ,以及能量传递过程中Chla分子由激发态辐射荧光衰退到基态以辐射荧光形式丢失能量的过程有关 5 5 0～ 6 70ps的时间组分 ,反映的是部分电荷重组的过程 2 6 0ps的组分只在 83K出现 ,应归于LHCⅡ中的Car分子经中间传递体传能到Chlb 6 39分子后继续将能量传递到反应中心P6 80的时间 30～ 4