同时检测猪瘟病毒和北美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的复合荧光定量RT-PCR方法的建立

应用猪瘟病毒(CSFV)及北美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)特异性引物和TaqMan水解探针,建立一种同时检测CSFV和PRRSV的复合荧光定量RT-PCR方法。该方法可检测到3.2 TCID50的CSFV和1.8TCID50的北美洲型PRRSV,比常规PCR方法敏感性高50倍以上。用复合荧光定量RT-PCR方法对155份现地样品进行检测,结果73份为PRRSV阳性,16份为CSFV阳性,13份为CSFV和PRRSV混合感染,与常规RT-PCR的符合率高达99.4%。该复合荧光定量RT-PCR方法敏感、特异、重复性好。

猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株复合实时荧光定量RT-PCR鉴别方法的建立

根据GenBank中的猪瘟病毒强毒和弱毒株基因组序列设计了1对针对猪瘟病毒的通用引物和2条分别针对猪瘟病毒强毒和猪瘟兔化弱毒疫苗株的特异性TaqMan水解探针，建立了一种能区分猪瘟病毒强毒和兔化弱毒疫苗株的复合实时荧光定量RT—PCR检测方法。结果显示，该方法能将我国大陆流行的不同基因亚群的猪瘟病毒强毒株与猪瘟兔化弱毒疫苗株完全区分开来，而不与其他猪源病毒发生非特异反应，分别可检测到初始模板中41．8和81．5个拷贝的病毒RNA，与已建立的复合RT-套式PCR的敏感性相近，两种方法对152份样品检测的符合率达96．9％～100％。通过对8份猪瘟兔化细胞疫苗效价的检测，证实本方法与兔体反应热测定法有一定的相关性，可用于猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗的定量和鉴别检测。

利用荧光定量RT-PCR和PCR方法检测结核分枝杆菌复合群

目的建立一种新的检测结核分枝杆菌复合群的荧光定量试验方法(R/P分析),探讨R/P分析检测临床标本中结核分枝杆菌复合群的应用价值。方法根据结核分枝杆菌复合群基因保守序列设计引物和探针构建质粒标准品。运用R/P分析检测54例确诊结核病人临床样本,检测的结果同时与培养法、荧光定量PCR法进行比较。结果不同临床标本用R/P分析诊断结核病,其敏感性高于荧光定量PCR法和培养法,阳性检出率分别为96.3%、83.3%和55.6%。结论 R/P方法是一种快速、特异的直接检测方法,它可以区分结核分枝杆菌复合群的死菌与活菌,因此可以更好的指导医生进行治疗,更准确地做出公共卫生决策。

人冠状病毒HCoV-NL63和HCoV-HKU1常规RT-PCR与实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用比较

分别设计HCoV-NL63和HCoV-HKU1特异的引物与荧光标记探针,并合成含靶基因的模板RNA,建立常规RT-PCR方法与实时荧光定量RT-PCR方法,对其灵敏性、特异性和可重复性以及用于临床样本的适用性等进行平行比较评价。结果表明:这两种方法皆可对HCoV-NL63或HCoV-HKU1进行特异性诊断,其中荧光定量RT-PCR方法检测灵敏度均可达10拷贝/25μL反应体积,不同批次重复检测结果间的变异系数均小于5%。上述方法应用于158份临床鼻咽拭子标本,其中荧光定量RT-PCR方法检出6份HCoV-NL63阳性标本,5份HCoV-HKU1阳性标本,而常规RT-PCR方法则分别检出HCoV-NL63阳性与HCoV-HKU1阳性各3份。对常规RT-PCR方法获得的阳性样品进行序列分析证实上述方法的可靠性。本实验成功建立了可用于临床标本检测的人冠状病毒HCoV-NL63和HCoV-HKU1常规RT-PCR方法与实时荧光定量RT-PCR检测方法,并初步证实荧光定量RT-PCR检测方法检出率明显高于常规RT-PCR方法,这为开展HCoV-NL63和HCoV-HKU1的流行监测及临床早期诊断提供了有效技术手段。

用实时荧光定量RT-PCR方法定量绵羊PrP基因的表达

为快速、准确定量绵羊PrP基因的mRNA,建立了绵羊PrP基因实时荧光定量聚合酶链反应检测方法。根据已报道的绵羊PrP基因序列,设计合成引物;采用RT-PCR方法扩增目的片段;构建标准重组质粒制备标准曲线,用于样品检测。结果发现,中枢神经系统组织PrP基因的表达量(copies/ng总RNA,39420)比外周组织(为7845)的高;在中枢神经系统中,脑干的PrP基因的表达量最高(为67020);外周器官中,淋巴结PrP基因的表达量最高(为29086),肾脏的表达量最低(为125)。建立绵羊PrP基因实时荧光定量PCR方法,对PCR扩增反应中每一个循环的产物进行定量分析,为进一步研究绵羊组织器官的PrP表达在传染性海绵状脑病发生中的作用提供基础数据。

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测禽呼肠孤病毒δC和δNS基因方法的建立

为建立一种定量检测禽呼肠孤病毒δC和δNS基因的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法,针对δC、δNS基因分别设计了1对特异性引物,同时选择了1对内参基因β-actin引物,将常规PCR扩增的片段分别连接到pMD18-T载体上构建重组质粒,经筛选、鉴定纯化后,梯度倍比稀释作为标准品,用于构建SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测δC、δNS基因及内参基因β-actin的标准曲线。结果表明,建立的标准曲线具有良好的线性关系,R2均在0.99以上;最小检出量为10拷贝/μL的阳性标准品,且具有良好的重复性,能够校正抽提样品中细胞数量不均带来的差异。可见,SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法能满足检测微量样品中禽呼肠孤病毒δC和δNS基因表达的要求,具有快速、敏感性高、重复性好等特点。

荧光定量RT-PCR快速检测手足口病病原研究

目的建立荧光定量RT-PCR技术用于检测手足口病的肠道病毒。方法利用TaqMan技术,设计一对共引物及探针,建立、优化反应体系后,构建质粒标准品,利用10倍稀释法建立相对定量标准曲线,根据TCID50倍比稀释,建立灵敏度曲线。特异性检验后利用临床标本与传统的RT-PCR法进行比较。结果定量标准曲线的灵敏度为105/μl(R2=0.999),PCR扩增效率为94%。灵敏度曲线显示检测到的最低浓度值为5.0TCID50/ml(R2=0.99),PCR扩增效率为97.6%。荧光RT-PCR检出率为80.9%,显著高于RT-PCR(检出率为62.92%)。结论研究建立的荧光定量RT-PCR方法检测肠道病毒敏感性高、特异性好、效率高,可以作为肠道病毒的快速检测方法。

实时荧光定量RT-PCR法检测手足口病患儿大便标本中肠道病毒71型

目的了解2008年手足口病流行期间住院手足口病患儿是否存在EV71病毒感染,并探讨实时荧光定量RT-PCR法对手足口病患儿大便标本中EV71病毒载量进行定量检测的可行性。方法采用RT-PCR荧光探针体外扩增法对47例住院的手足口病患儿大便标本中抽提的RNA进行抽样检测。结果22例(46.81%)手足口病患儿大便标本中EV71的病毒载量大于103copies/ml,最高者达1.03×107copies/ml。实时荧光定量RT-PCR法其标准曲线显示,Ct值与病毒拷贝数的对数(log10)之间的相关系数为1.000,相关性较好。结论2008年手足口病流行期间入住儿科医院的手足口病患儿近半数为EV71病毒感染。实时荧光定量RT-PCR法对大便标本中的EV71RNA定量检测较方便快捷,结果直观,为进一步研究病毒载量与临床表现之间的关系打下了基础。

口蹄疫病毒一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的建立一种能快速、高效、敏感、特异地检测口蹄疫病毒(FMDV)的一步法荧光定量RT-PCR检测方法。方法根据FMDV聚合酶3D基因序列比对结果,设计特异性引物和MGB探针;通过优化,得到最佳反应体系和反应条件;分别以质粒和病毒RNA为模板,构建标准曲线;并进行特异性、敏感性、重复性试验。结果该方法能特异性检测A型、O型、Asia 1型FMDV,而对猪瘟、猪蓝耳病、猪圆环病毒、猪细小病毒、猪狂犬病毒、猪乙型脑炎等病原检测结果均为阴性;构建的荧光定量标准曲线Ct值与模板浓度呈良好的线性关系,检测质粒的敏感性可达83.4copies/μL,检测病毒RNA的敏感性可达7.1fg/μL,比多重RT-PCR敏感性高10倍;对4份样品进行5次批内和批间重复检测,检测结果变异系数均小于2%。结论建立的口蹄疫病毒一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于口蹄疫临床样品诊断、流行病学调查和畜产品安全监测。

鸭坦布苏病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据鸭坦布苏病毒(DTMUV)BYD-1株基因序列设计特异性引物和TaqMan探针,建立了快速检测DTMUV的实时荧光定量RT-PCR方法。特异性结果显示,DTMUV显示阳性,而3株非鸭坦布苏病毒均显示阴性,说明该方法具有高度特异性。其表达式为Ct=-3.32×lg Copy number+41.151,R2=0.998,R循环效率Eff%=100.072,DNA拷贝数在101～108范围内检测曲线有良好的线性关系,对质粒标准品最低检测限为1.0×101拷贝/μL,变异系数低于5%。利用该方法分别对攻毒感染具有典型鸭新型黄病毒病临床症状和病理变化的蛋鸭的脾脏和肝脏组织进行检测,阳性率均为100%,而用本实验室建立的普通RT-PCR方法检测的阳性检测率为85%(17/20)和75%(15/20)。建立的方法具有敏感性高、特异性好、稳定性强的特点,可用DTMUV早期感染的快速诊断和流行病学调查。

实时荧光定量RT-PCR检测中、强毒力新城疫病毒RNA

根据新城疫病毒(NDV)核苷酸序列,设计针对中、强毒力NDV F基因编码融合蛋白裂解位点的核苷酸序列引物和TaqMan探针,建立了实时荧光定量反转录荧光定量PCR(RRT-PCR)检测中、强毒力NDV RNA的方法。该方法能从含有NDV系疫苗毒、NDV标准强毒株F48E9(基因型)、分离鸡源强毒株(基因型)和鸽源强毒株(基因型)样本中检出NDV RNA,不与NDV弱毒株(LaSota、Clone30、B1、V4)、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊炎病毒及健康鸡组织RNA发生交叉反应,对NDV核酸的最小检出量为60个拷贝,具有检测速度快、特异性强、灵敏度高、重复性和稳定性好等特点。从9个临床样本中均检测出阳性信号(9/9),PCR产物经测序证明均含有NDV强毒株F基因裂解位点;用其中8份病料接种SPF鸡胚分离病毒,分离率为5/8。

小反刍兽疫病毒及山羊痘病毒N-ITR基因二联实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为实现山羊2种疫病病原体——小反刍兽疫病毒(PPRV)和山羊痘病毒(GTPV)的同步快速检测,基于PPRV的N基因及GTPV的ITR基因,分别设计合成2套特异性引物及探针;探针分别用5′FAM-TAMRA3′及5′JOE-Eclipse3′标记物进行标记以实现同步检测。试验结果显示,所建立的N-ITR二联探针实时荧光定量RT-PCR方法可同步检测PPRV和GTPV,产生特异性荧光信号,而对禽痘病毒(FPV)、犬瘟热病毒(CDV)等相关病毒无荧光信号检出。以PPRV-N和GTPVITR的pMD18-T载体质粒为标准品,构建了二联标准曲线,N-ITR探针对PPRV和GTPV的检测敏感度可分别达102和103拷贝/μL。本研究初步建立了可同步快速特异性检测PPRV和GTPV的二联实时荧光定量RT-PCR方法。

嗜人按蚊溴氰菊酯抗性分子机理研究 Ⅲ 嗜人按蚊P450基因mRNA荧光半定量RT-PCR分析

目的探讨嗜人按蚊CYP6、CYP4基因与溴氰菊酯抗性的关系。方法采用荧光定量 RT-PCR方法,对嗜人按蚊体内CYP6和CYP4基因的mRNA进行半定量检测分析。结果嗜人按蚊抗性品系中CYP6基因mRNA的含量约为敏感品系的1．39倍。抗性品系中CYP4基因mRNA 的含量约为敏感品系的3．63倍。结论嗜人按蚊抗性品系体内的CYP6和CYP4的mRNA量高于其敏感品系,提示嗜人按蚊溴氰菊酯产生抗性机理可能与其细胞色素P450表达量增高有关。

荧光定量RT-PCR快速检测A、B型流感病毒的研究

目的利用荧光定量RT-PCR技术建立一种快速检测A、B型流感病毒的方法。方法根据A型流感M基因和B型流感HA基因的相对保守序列,分别设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立、优化单一和双重反应体系后,利用10倍稀释法对已知滴度的流感病毒进行梯度稀释,检验方法的灵敏度并建立相对定量标准曲线。结果A、B型流感病毒双重反应的灵敏度为分别为2·56×10-5和5·0×10-5TCID50,标准曲线相关系数分别为0·997和0·998,扩增效率分别为114·1%和107·8%,说明双重反应中A、B型的引物、探针、模板之间无相互干扰,具有很好的稳定性和重现性。结论研究建立的荧光定量RT-PCR技术可以准确同时检测A、B型流感病毒,不仅灵敏度高、稳定性好,而且可以对病毒滴度进行定量检测。

西安市景观水体肠道病毒实时荧光定量RT-PCR检测与健康风险评价

根据肠道病毒基因非编码区保守序列的同源性设计肠道病毒通用引物,建立环境水体中肠道病毒的实时定量RT-PCR检测方法,对西安市的主要景观水体进行1 a的连续监测。通过统计分析数据,对肠道病毒感染的健康风险进行评价。结果表明,兴庆湖和北湖的肠道病毒检出浓度符合对数正态分布,浓度随季节变化波动明显,全年浓度几何平均值分别为16.05 copy/L和5.06 copy/L。肠道病毒与细菌总数、大肠菌群、粪大肠菌群等指标均无显著的相关性。根据景观用水的暴露评价和脊髓灰质炎病毒1型、柯萨奇病毒A21和B4型,埃可病毒12型的剂量-反应关系,计算得出兴庆湖和北湖中的各种肠道病毒感染的年风险分别为1.05×10^(-2),1.66×10^(-2),1.47×10^(-2);3.27×10^(-3),5.20×10^(-3),4.59×10^(-3)。结果表明这些景观水体已受到肠道病毒的污染,进一步加强城市景观水体肠道病毒的监测是十分必要的。

狂犬病病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立与初步应用

目的建立狂犬病病毒快速检测法。方法根据狂犬病病毒核蛋白基因的保守序列分别设计两对引物及其相应的TaqMan探针。构建pMD-N重组质粒,建立荧光定量RT-PCR绝对定量标准品,并对反应体系进行优化,建立绝对定量的标准曲线。利用10倍稀释法检验方法的灵敏度并与普通RT-PCR法进行比较;作重复性和特异性检验后进行临床标本的检测。结果构建了绝对定量的参照质粒,标准曲线相关系数为0.998。狂犬病病毒荧光定量RT-PCR检测反应的灵敏度为10个TCID_(50);5种非狂犬病病原体检测均为阴性。结论建立的狂犬病病毒的荧光定量RT- PCR检测方法快速、特异性强、灵敏度高、稳定性好,可以应用于临床样品的检测。

猪瘟兔化弱毒疫苗株TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种快速鉴定猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)的方法,本研究根据GenBank中登录的HCLV株基因组序列,在Erns基因序列区内设计一对引物和一条TaqMan探针,建立了检测HCLV的荧光定量RT-PCR(FQRT-PCR)方法。该方法检测的灵敏度可达3.84拷贝/μL;而对猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、牛病毒性腹泻病毒基因组扩增结果均为阴性。实验组批内变异系数为1.05%～1.84%,批间变异系数为3.70%～5.43%。通过对32批HCLV半成品抗原和9批成品疫苗,分别用经典的兔检法测定兔体感染量(RID)和新建立的FQRT-PCR方法进行检测比较,两者有较好的相关性。结果表明,该方法具有快速、敏感、特异性强、稳定性好等优点,对HCLV生产配制及成品检验具有指导作用。

荧光定量RT-PCR检测神经母细胞瘤细胞MYCN基因mRNA的表达

目的MYCN基因表达对神经母细胞瘤的治疗及预后评估有指导意义,目前国内对于MYCN基因mRNA的定量检测未见报道,该研究拟采用SYBR绿色荧光染料Ⅰ(SYBRGREENⅠ)实时检测的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,检测神经母细胞瘤细胞系LA-N-5细胞MYCN基因mRNA的表达,并对其可行性及实用性进行研究,力争探索出微量瘤标本的MYCN基因mRNA定量检测的可行方法。方法提取神经母细胞瘤细胞系LA-N-5细胞总RNA,采用SYBRGREENI实时检测的RT-PCR检测其MYCN基因mRNA的表达,并用3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参照,将MYCN基因的mRNA拷贝数与GAPDH的拷贝数相除,结果为单细胞MYCN基因mRNA的表达水平。结果反应标准曲线有良好的相关性(R2>0.99),PCR产物特异,神经母细胞瘤细胞系LA-N-5MYCN基因mRNA的表达水平为17.4±1.2。结论只要严格控制PCR反应条件,SYBRGREENⅠ定量RT-PCR法可以作为一种良好的定量PCR方法对神经母细胞瘤细胞系LA-N-5MYCN基因mRNA的表达进行检测,此方法为临床微量神经母细胞瘤瘤组织的MYCN基因mRNA的定量检测提供了可能。

TaqMan荧光定量RT-PCR快速检测登革1、2型病毒

目的建立特异、灵敏、快速的荧光定量RT-PCR方法用于检测登革1、2型病毒核酸,并初步应用于登革热的临床标本检测。方法根据GenBank登录的登革热毒株序列,应用生物学软件进行序列比对,分别在登革病毒1型的NS5基因和2型的C基因的保守区设计特异性引物和TaqMan探针。对荧光定量RT-PCR反应条件进行优化,验证该方法的特异性、灵敏度和稳定性。同时对疑似登革热病例血清标本进行检测。结果该方法对登革1、2型病毒的检测有高度的特异性,与登革病毒的4个血清型之间以及流行性乙型脑炎病毒、肾综合征出血热病毒等均无交叉反应,检测的灵敏度均达0.1TCID50,可从疑似登革热病例血清标本中直接检测登革病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3h左右。结论本研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR是一种快速检测登革1、2型病毒特异、敏感的方法,适用于临床早期诊断。

荧光定量RT-PCR快速检测A型流感病毒的研究

目的利用荧光定量RT-PCR技术建立一种快速检测A型流感病毒的方法。方法根据A型流感M基因的相对保守序列分别设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立、优化反应体系后,利用10倍稀释法检验方法的灵敏度并建立相对定量标准曲线;特异性检验后利用临床标本与传统的血凝抑制法进行比较。结果A型流感病毒检测反应的灵敏度为2.56×10-6TCID50,标准曲线相关系数为0.999,扩增效率为108.5%,5种非A型流感病毒病原体检测均为阴性,说明此方法只有很好的稳定性、重现性和特异性。结论本研究建立荧光定量RT-PCR技术可以准确检测A型流感病毒,不仅灵敏度高、稳定性好,而且可以对病毒滴度进行定量检测。