影响基因工程猪生长激素复性效率的因素

对影响基因工程猪生长激素 (r pGH)体外复性效率的因素进行了研究 ,结果表明 :复性液组成、变性剂种类、复性方法的选择、变复性pH对r pGH体外复性效率有较大影响 ,β 巯基乙醇、谷光苷肽等添加剂对r pGH的体外复性影响不显著。提取包含体用 6mol L盐酸胍溶解 ,空气氧化 80h后转入复性缓冲液中开始重组蛋白复性 ,采用透析复性法———复性缓冲液Ⅲ (0 .2 5 %NaHCO3,0 .2 %α 乳糖 ,0 .2 %甘露醇 ) ,pH9.0 ,透析 5～ 6次 ,可较好地恢复r pGH生物活性。复性后蛋白浓缩液进行去垂体大鼠试验 ,大鼠增重明显 ,表明得到了正确折叠的较高生物活性的r pGH。

四氢糠醇对α-胰凝乳蛋白酶在液相色谱中复性效率的影响

用高效疏水相互作用色谱 (HPHIC)研究了将四氢糠醇加入盐酸胍 (GuHCl)变性剂中或将四氢糠醇键合至硅胶基质时 ,对α 胰凝乳蛋白酶 (α Chy)复性效率的影响情况 ,并以α Chy的生物活性回收率对结果进行了表征。用尺寸排阻色谱 (SEC)与HPHIC的实验结果进行了比较 ,结果表明 ,四氢糠醇在变性剂中和键合至硅胶上时 ,均可提高α Chy的复性效率 ,但提高的程度不同。四氢糠醇在溶液中或在HPHIC固定相表面时具有辅助α Chy进行复性作用的机理可能是由于四氢糠醇与α Chy形成了复合物的形式。

重组羧肽酶原B的复性及纯化

目的 建立重组羧肽酶原B复性方法及活性羧肽酶B的纯化方法。方法 重组大肠杆菌发酵后 ,表达的羧肽酶原B包涵体经洗涤、变性 ,采用凝胶过滤的方法对其进行复性及纯化。所得的复性液经Trypsin酶解后 ,采用DEAE FF阴离子交换层析进行羧肽酶B的分离纯化 ,并采用SDS PAGE检测纯度。结果 经凝胶过滤后得到了复性和纯化的羧肽酶原B包涵体 ,在蛋白终浓度相同的情况下 ,复性效率比稀释复性提高了 5 0 % ,经DEAE离子交换柱一步纯化 ,得到了活性羧肽酶B ,纯度达到 90 %以上。以Hippuryl -L arg为底物测活 ,得到的活性酶的比活为 15 0u mg。结论 所建立复性方法及纯化方法为进一步的研究奠定了基础。

重组人EC-SOD包涵体的稀释复性及重折叠后蛋白的纯化

目的确定重组人ECSOD包涵体体外稀释复性和复性后蛋白纯化的适宜方法。方法通过对pH、温度、包涵体蛋白浓度、尿素和精氨酸浓度及氧化还原对比率的定性定量分析,研究重组人ECSOD包涵体体外稀释复性的基本条件。采用金属离子亲和柱(IMAC)和肝素亲和柱(Heparinsepharose)对复性蛋白进行纯化,比较纯化效率的差异。结果最佳复性条件为pH8.5,尿素浓度为1.5molL,精氨酸浓度大于0.3molL,GSH∶GSSG=4∶1;复性温度及包涵体蛋白终浓度越高,复性效率越低。IMAC和Heparinsepharose亲和柱均可用来纯化复性蛋白溶液,但Heparinsepharose纯化效率较高。结论确定了重组人ECSOD包涵体体外稀释复性的最佳条件及复性后蛋白纯化的方法。