丙二酸盐克罗诺杆菌PspA包涵体蛋白的表达、复性及纯化方法优化

为研究丙二酸盐克罗诺杆菌(Cronobacter malonaticus)中噬菌体休克蛋白A(phage shock protein A,PspA)的结构与功能,文章构建了PspA融合蛋白表达载体,但重组蛋白以包涵体形式大量表达;为获取较高浓度的可溶性蛋白进行后续探究,使用尿素裂解液使蛋白变性后,经多种方法复性GST-PspA包涵体蛋白,使其重新恢复生物学活性。研究结果表明,4℃低温条件下包涵体蛋白经尿素梯度稀释透析以控制复性速率,防止蛋白分子快速聚集,可以实现高效复性和纯化GST-PspA融合蛋白。为进一步探索Psp系统中各蛋白的功能及相互作用的研究提供一定的参考。

大肠杆菌表达包涵体蛋白体外复性研究进展

包涵体形成是大肠杆菌表达重组蛋白常见的问题。因此,为获得大量的活性蛋白而对其包涵体进行复性的研究引起了人们极大兴趣。本文综述了近年来发展起来的低分子量添加物、反胶团、分子伴侣、层析复性等新的复性方法、复性检测方法和体外复性机制。

包涵体蛋白质的复性研究进展

外源基因在大肠杆菌中高效表达时,通常会形成不溶性、无活性的蛋白聚集体——包涵体。包涵体中富含表达的重组蛋白质,它们经分离、洗涤、变性溶解以及复性等过程才能得到具有生物活性的蛋白质。近年来,随着对包涵体体外复性机制的深入研究,从包涵体中复性重组蛋白质已经有了很多的策略和方法。文章就有关工作的进展进行了综述。

SA-TNF-α融合蛋白高效表达、纯化及复性研究

目的研究链亲和素标记的人肿瘤坏死因子α(SA-TNF-α)融合蛋白的纯化、复性方法,并研究其生物学功能。方法在大肠杆菌中表达SA-TNF-α融合蛋白,对表达的SA-TNF-α融合蛋白采用镍金属螯合(Ni-NTA)层析柱进行纯化,分别在尿素体系和盐酸胍体系中复性,Western blot对其进行鉴定。MTT法检测SA-TNF-α融合蛋白对L929细胞的杀伤活性,流式细胞仪分析SA-TNF-α融合蛋白对生物素化的MB49细胞锚定修饰率。结果SA-TNF-α融合蛋白在大肠杆菌中实现了高效表达,表达的目标蛋白占菌体蛋白30%以上,镍金属螯合(Ni-NTA)层析柱纯化的SA-TNF-α融合蛋白纯度达到95.7%,经过两种体系复性形成的SA-TNF-α融合蛋白的二聚体和多聚体均具有双功能活性:既对L929细胞有杀伤活性又能锚定修饰生物素化的MB49细胞,锚定修饰率大于90%。结论初步建立了SA-TNF-α融合蛋白制备工艺,SA-TNF-α二聚体和多聚体均具有双功能活性,SA-TNF-α融合蛋白的研制有望为肿瘤的治疗提供新的治疗方法及新型药物。

重组蛋白包涵体的复性研究

重组蛋白在大肠杆菌中的高表达往往形成不可溶、无生物活性的包涵体,需经过变性溶解后,在适当条件下复性形成天然的构象,才可恢复其生物活性.变复性实验是建立在对蛋白质体外折叠机制的了解的基础上.根据近年来对蛋白质折叠机制的认识和重组蛋白包涵体在复性方面的主要进展,论述以下3个方面的内容1)蛋白质在细胞内的折叠机制;2)蛋白质体外折叠机制;3)蛋白质复性的策略和方法.

包涵体蛋白的变复性研究

针对基因工程蛋白在E.coli中表达多为无活性包涵体的特点,介绍了包涵体洗涤和去折叠的方法、蛋白质体外折叠的过程和机理、体外复性技术以及复性蛋白的检测,着重讨论了最近发展起来的蛋白质复性新技术.

表面活性剂辅助溶菌酶复性:表面活性剂-蛋白质复合物结构分析

研究了十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)辅助天然溶菌酶的复性过程及其影响因素 .发现向复性液中单独添加低浓度CTAB即可导致溶菌酶复性 ,且当变性溶菌酶浓度在 0 2mg·ml-1以上、CTAB与溶菌酶的摩尔比为 10时复性效果最佳 .采用表面张力、离子交换色谱、非还原性SDS PAGE及荧光发射光谱法对复性体系进行物性和结构分析 ,显示CTAB可与变性溶菌酶形成不同结构的表面活性剂 蛋白质复合物 ,且复合物的组成和结构可随时间发生变化 .最后 ,对于表面活性剂

重组骨形态发生蛋白-7的复性及纯化

目的探讨重组骨形态发生蛋白-7(rhBMP-7)的复性及纯化获得高纯度rhBMP-7二聚体的方法。方法表达rhBMP-7的工程菌经发酵、裂菌、提取包涵体后,4℃下依次在尿素浓度为4、2、1 mol/L的磷酸盐缓冲液中透析使蛋白复性,然后再通过层析色谱纯化去除杂蛋白。结果纯化后rhBMP-7以单体和二聚体形式存在,纯度达95%以上,其中rhBMP-7二聚体含量可达60%以上。结论初步建立了先复性然后在低脲浓度下纯化的方法,能够获得含量较高的rhBMP-7二聚体。

蛋白质复性的分子排阻色谱法的研究进展

包涵体蛋白质复性是生物工程下游技术中的一个重要问题。利用传统的方法复性复性率低和步骤繁琐 ,无法用于大规模生产。最近出现的层析复性方法 ,具有较强的优势。其原理是将层析技术应用于蛋白质复性和纯化 ,使变性蛋白质在层析柱上折叠为正确的空间构象 ,在洗脱的同时实现部分纯化。在层析技术中分子排阻色谱法由于操作简便 ,复性效率高 ,成为研究的重点。文章就分子排阻色谱法的研究情况作一综述。

表面活性剂辅助重组蛋白质复性

以重组人溶菌酶(rhLys)与重组β甘露聚糖酶(rMan)为体系,综合采用活性测定、非还原性SDSPAGE以及荧光发射光谱分析等方法研究了十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、CTAB与β环糊精(βCD)组成的人工分子伴侣以及其他种类复性助剂对重组蛋白质复性过程的影响.结果表明CTAB及人工分子伴侣均可有效地辅助rhLys复性,且rhLys与鸡卵清溶菌酶(Lys)呈现出类似的复性过程特性;人工分子伴侣可显著地提高rMan在高浓度下的复性率;表面活性剂带电性质、表面活性剂与蛋白质的摩尔比以及变性蛋白质的浓度等是影响复性率及复性产品分布的主要因素.这些结果对于此类复性技术应用于重组蛋白体系时的工艺选择和优化提供了重要的依据和参考.

蛋白质复性技术研究进展

评述了蛋白质复性研究的科学背景及蛋白质折叠机制的研究现状 ,详细介绍近年来蛋白质复性技术的研究进展 ,包括稀释添加技术和各种辅助因子的作用、固定化辅助因子应用。

分离技术在蛋白质复性中的集成化应用及分析

针对蛋白质复性这一基因工程蛋白质生产过程中的难点问题,着重介绍了一些蛋白质分离技术如超滤、反胶团萃取和凝胶萃取等在蛋白质复性及分离方面的集成化应用,并逐一分析了各自的作用机理及应用过程中所涉及到的一些共性及不同点,希望能够借鉴于相对成熟的蛋白质分离技术,促进蛋白质复性技术的进一步发展.

体外蛋白质复性方法及小分子添加剂在复性过程中的作用

变性蛋白质体外复性的方法主要有传统的辅助复性法包括了:稀释法、透析法、超滤法以及蛋白质折叠液相色谱法(PFLC),也有在此基础上模拟体内分子伴侣、折叠酶、人工分子伴侣、反胶束的辅助复性方法。到目前为止,在复性液中添加小分子试剂是提高体外辅助蛋白质复性效率的策略之一。其目的是为了降低蛋白质复性过程中聚集形式的形成,从而促进变性蛋白质向其天然和活性构象的转变。这种方法在一定程度上能够提高蛋白质的复性效率并且得到了长足的发展。为了捕捉变性蛋白质向其活性结构折叠过程的差异性变化规律,明确小分子添加剂对体外辅助蛋白质分子折叠过程的机制,推测一些小分子添加剂辅助蛋白质色谱复性过程中构象的变化规律,为解决包涵体蛋白质难于复性和复性效率低的问题起到指导性的作用。

脲变性α-糜蛋白酶的高效液相色谱复性

目的研究变性蛋白质在高效疏水作用色谱(HPHIC)固定相表面上的保留行为及活性回收率。方法用脲将标准蛋白质α-糜蛋白酶(α-Chy)变性,然后以硫酸铵为流动相,用HPHIC固定相(TSK)对脲变性α-Chy进行复性,并测定复性α-Chy的Z值、质量及活性回收率。结果Z值随脲浓度的增大而减小,变性剂浓度在1.0～3.0mol·L-1范围内时,HPHIC对变性α-Chy有较高的活性回收率。结论HPHIC是变性蛋白复性的有效工具,蛋白质与固定相之间的疏水作用是蛋白折叠的主要驱动力。

四氢糠醇对α-胰凝乳蛋白酶在液相色谱中复性效率的影响

用高效疏水相互作用色谱 (HPHIC)研究了将四氢糠醇加入盐酸胍 (GuHCl)变性剂中或将四氢糠醇键合至硅胶基质时 ,对α 胰凝乳蛋白酶 (α Chy)复性效率的影响情况 ,并以α Chy的生物活性回收率对结果进行了表征。用尺寸排阻色谱 (SEC)与HPHIC的实验结果进行了比较 ,结果表明 ,四氢糠醇在变性剂中和键合至硅胶上时 ,均可提高α Chy的复性效率 ,但提高的程度不同。四氢糠醇在溶液中或在HPHIC固定相表面时具有辅助α Chy进行复性作用的机理可能是由于四氢糠醇与α Chy形成了复合物的形式。

RNase等10种标准蛋白质在高效疏水作用色谱上的复性

目的: 研究变性蛋白质在高效疏水作用色谱(HPH IC)上的保留行为及复性效率. 方法: 分别用盐酸胍(Gu HCl)、尿素(Urea)和十二烷基磺酸钠(SDS)将核糖核酸酶(RNase)等10种标准蛋白质变性,然后在流动相为硫酸铵的条件下,用HPHIC对变性蛋白质进行复性,并测定其保留时间、Z值、质量及活性回收率. 结果: 在10种变性蛋白质中有5种在HPHIC上得到复性,其保留时间、峰形、Z值与天然蛋白基本一致,其中溶菌酶和核糖核酸酶的质量和活性回收率高,复性效果好. 结论: 用HPHIC对变性的标准蛋白质进行复性,得到较好的复性效果.

热休克蛋白基因的克隆表达及与包含体蛋白复性的研究

用基因工程技术在原核细胞中高效表达的外源基因常常形成不溶性的包含体,目前常用的方法对包含体蛋白的复性效率很低,极大地降低了目的蛋白的生物活性,限制了生物技术的开发应用,成为当今分子生物学快速发展的一大障碍。目前研究的大多数热休克蛋白都具有分子伴侣的作用,参与细胞内新生蛋白分子的正确折叠,其本身并不成为成熟蛋白分子的一部分。PKhsp是在日本Kagoshima Kodakara一温泉中分离到的一株耐热古细菌KOD1中发现的热休克蛋白。

包涵体蛋白的层析复性技术研究进展

包涵体蛋白的复性是生物工程下游技术中的一个重要难题。层析法用于蛋白质复性是一种较新的、适用于大多数蛋白的方法。其原理是将层析技术应用于蛋白质复性和纯化,使变性蛋白质在层析柱上重折叠为正确的空间构象,在洗脱的同时实现部分纯化。本文详细介绍了蛋白质在5种层析柱上的复性方法、原理、应用及研究的新进展,为层析法对蛋白质复性的进一步应用提供依据。

基于超滤膜电渗流动建立尿素梯度及其应用于蛋白质复性

建立了由超滤膜隔开的5腔室电泳装置,利用超滤膜的电渗流动来建立中间腔室中沿流动方向上的尿素梯度,在此梯度中实现蛋白质与尿素及其它变性剂的分离,并进而导致蛋白质的复性. 建立了描述尿素梯度的模型并进行了实验验证,考察了牛血清白蛋白在此尿素梯度中的复性,证实了此技术的可行性并显示了很好的应用前景.