ICC-qPCR病毒灭活验证方法的建立及其应用

目的:建立细胞培养-核酸扩增荧光定量PCR(integrated cell culture quantitative PCR,ICC-qPCR)病毒灭活验证方法;结合传统细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)法,考察ICC-qPCR方法的适用性;利用这2种方法验证复用电生理导管环氧乙烷病毒灭活工艺的有效性。方法:通过制备指示病毒(伪狂犬病毒,PRV)质粒DNA作为定量标准品,用PRV特异性引物建立定量PCR方法;再用PRV病毒侵染宿主细胞,同时用热灭活PRV作为对照,确定PRV活病毒全部进入宿主细胞但不扩增的最佳样本收获时间,通过检测细胞中活病毒,建立ICC-qPCR活病毒检测方法;确立CPE法测定滴度与ICC-qPCR法检测DNA拷贝数之间的线性关系。最后,模拟临床使用的最坏情况对一次性电生理导管进行含指示病毒(PRV)生物污染物负载,模拟环氧乙烷病毒灭活工艺,通过ICC-qPCR和CPE法验证病毒灭活工艺的有效性。结果:本研究中建立的ICC-qPCR方法的标准曲线线性关系r2>0.99;定量下限为104 copies·μL^(-1),约相当于2 logs·mL^(-1),检测下限为103copies·μL^(-1),约相当于-1 logs·mL^(-1);特异性结果表明只能检测到PRV的扩增曲线,无非特异性扩增;重复性试验的RSD<5%。确定ICC-qPCR方法中PRV最佳收获时间为宿主细胞染毒后1～2 h。ICC-qPCR检测拷贝数与病毒滴度间具有良好的线性关系(r2>0.99)。ICC-qPCR法病毒灭活工艺验证结果表明:经环氧乙烷灭活后病毒负载导管其病毒滴度降低>9.0 logs;阴性对照组(负载不含PRV生物污染物)和空白导管样品均未检出病毒DNA。CPE法的病毒滴定结果表明,经环氧乙烷灭活后病毒负载导管其病毒滴度降低≥8.5 logs·mL^(-1);阴性对照组和空白导管样品均未检出PRV。结论:本研究建立的ICC-qPCR方法应用于PRV病毒灭活验证,可以有效检测活病毒,比传统CPE法(-0.5 logs·mL^(-1))灵敏度高。将此方法应用于复用电生理导管的环氧乙烷病毒灭活工艺验证,同时与CPE法进行比较,验证了ICC-qPCR方法的适用性以及环氧乙烷灭活电生理导管负载的PRV病毒的工艺有效性。