副溶血弧菌一种糖蛋白酶(复苏促进因子)在大肠杆菌中的表达及性质

用PCR方法从副溶血弧菌8621.4基因组中扩增出1种细胞复苏促进因子家族的糖蛋白酶(Glycoprotease,Gcp)基因,核酸序列分析表明其含有完整的gcp基因开放阅读框,编码233个氨基酸组成的蛋白质。核酸序列与副溶血弧菌糖蛋白酶家族基因的序列相似性为100%。其氨基酸序列与哈维氏弧菌HY01、弧菌Ex25、溶珊瑚弧菌、拟态弧菌和杀鲑弧菌LFI1238等糖蛋白酶的序列相似性为67%～92%。将该基因克隆到表达载体pET28a,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,用Ni琼脂糖亲和柱层析纯化的蛋白为单一条带,利用纯化的Gcp免疫新西兰大白兔制备特异性抗体,Western-Blotting分析发现正常生长及活的非可培养状态(VBNC)诱导过程中的副溶血弧菌细胞内表达的Gcp蛋白为1条带,分子量约为27kDa,而在VBNC状态的菌体中检测到2条蛋白带。研究结果为进一步探索海洋弧菌活VBNC的形成和复苏机制奠定基础。

细菌复苏促进因子──Rpf

细菌复苏促进因子Rpf是第一个被发现的原核生物自分泌生长因子,该因子在放线菌门细菌中广泛存在,具有促进细菌休眠体复苏的作用。Rpf在细菌生长代谢过程中所发挥的重要调节作用,使其具有潜在的应用价值。

结核分枝杆菌复苏促进因子基因克隆及其蛋白质的表达

目的通过对结核分枝杆菌复苏促进因子基因的克隆、融合蛋白的表达、纯化，以获得高活性的结核分枝杆菌复苏促进因子蛋白质。为临床标本结核分枝杆菌复苏培养及功能研究提供物质基础。方法通过PCR扩增结核分枝杆菌H37Rv的5个复苏因子基因，经内切酶酶切、胶回收，将片段亚克隆到T载体中，转化至DH5α。以PCR鉴定的阳性菌落转至LB中培养，菌液进行质粒提取、酶切、胶回收，回收片段再克隆至表达载体pET30a中，转化至DH5α中。PCR阳性菌落转至LB中培养，测序确定插入片段的正确性，菌液提取质粒，并再转化至BL21（DE3）中。经PCR鉴定阳性的菌液通过适当的IPTG浓度诱导，适宜温度和时间下，诱导蛋白表达，经SDS—PAGE电泳分析，Western blot检测目的蛋白，在最佳条件下大量表达目的蛋白，并纯化。结果获得有活性的高纯度复苏促进因子蛋白，纯度〉90％。结论复苏促进因子蛋白的成功表达为下一步摸索临床标本结核分枝杆菌复苏培养最佳方案及复苏基因的功能研究打下良好基础。

细菌复苏促进因子

复苏促进因子(Rpf)是存在于原核生物中的一类因子,该因子能够在皮摩尔水平以自分泌/旁分泌形式促进休眠菌的复苏和生长,其作用机制可能是参与了细胞间的信号转导,类似于真核生物的生长因子。Rpf广泛存在于高GC含量的革兰阳性菌中,最近在低GC含量的革兰阳性菌中也发现了复苏促进因子。国内外研究表明,如果能够揭开该因子的作用方式,有可能破解休眠菌的复苏机制,因此,有必要对该类因子研究进展做系统的总结。

复苏促进因子研究进展

复苏促进因子是一类广泛存在于结核分枝杆菌等革兰阳性菌中的蛋白质,能促进休眠菌复苏。复苏促进因子的作用机制目前仍然是未知的,然而对此类蛋白的结构域预测及核磁共振分析显示其保守区具有溶菌酶样折叠。我们简要综述了国外对此类蛋白作用机制的研究进展。

结核分枝杆菌中的复苏促进因子

自然界中的微生物在处于不利环境时可进入休眠状态,也就是常说的“活的非可培养状态”(VBNC)。当给予适合的环境条件后又可恢复其生长活性。研究表明,某些革兰阳性菌可分泌一种蛋白质,即能够有效促进多种处于休眠期细菌复苏的生长因子,称为复苏促进因子(resuscitation-promoting factor,Rpf)。结核分枝杆菌的Rpf是一个蛋白家族,共包含RpfA^E 5个成员,编码这5个蛋白质的基因与藤黄微球菌的rpf基因有显著的同源性。它们执行的生物学功能并不完全相同但又有部分的重叠,推测这5个Rpf蛋白之间可能有某种协同作用。

复苏促进因子增效PACT处理印染废水

利用复苏促进因子(resuscitation-promoting factor,Rpf)促进活的但不可培养(viable but nonculturable,VBNC)的细菌复苏和生长的特性,通过序列间歇式活性污泥法(SBR)实验,探究用Rpf增效粉末活性炭活性污泥工艺(powder activated carbon treatmeat,PACT)处理印染废水的最佳工况,同时研究了Rpf对活性污泥的强化机理和对微生物的影响。实验选用302型木质粉末活性炭(PAC),得到最佳投加条件为PAC 30 mg·L^(-1)·d^(-1),Rpf 6 mg·L^(-1)·(3 d)^(-1)。实验表明,PAC和Rpf具有协同作用,可改善污泥的沉降性能,增强传统PACT的生化处理能力,提高活性污泥微生物的多样性,增大种群丰度,使系统稳定高效运行。

复苏因子薄层琼脂快速培养法诊断结核性胸膜炎的应用研究

目的建立胸腔积液结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)复苏因子薄层琼脂(Rpfs-TLA)快速培养法并评估其临床应用价值。方法收集2016年7月至2018年11月北京胸科医院103例结核性胸膜炎和34例其他胸膜疾病患者的胸腔积液,经过离心、消化处理后进行M.tb复苏因子薄层琼脂和普通薄层琼脂培养,比较Rpfs-TLA与普通TLA培养M.tb的阳性率、平均报阳时间、菌落形成单位数的组间差异。结果胸腔积液Rpfs-TLA培养组和普通TLA对照组M.tb的阳性率分别为43.7%和29.1%,差异有统计学意义(χ^ (2)=54.56,P<0.001)。Rpfs-TLA培养显微镜下微菌落与肉眼可视菌落平均报告时间为11.87 d和18.13 d,差异有统计学意义(t=31.82,P<0.001)。Rpfs-TLA与普通TLA培养显微镜下微菌落的平均报告时间为11.87 d和20.60 d,差异有统计学意义(t=16.62,P<0.001)。Rpfs-TLA诊断结核性胸膜炎的灵敏度为43.7%,特异度为100%,准确度为57.7%。结论Rpfs-TLA是一种准确、快速、廉价且易于培养的方法,可为结核性胸膜炎诊断提供帮助。

结核分枝杆菌复苏因子Rv2450c基因的克隆、表达和纯化

目的对结核分枝杆菌复苏因子Rv2450c基因克隆、并测序正确后进行融合蛋白表达、纯化。方法通过PCR扩增结核分枝杆菌H37Rv复苏因子Rv2450c基因，酶切，克隆至PGEM—TEasy质粒，测序确定插入片段的正确性．再克隆至表达载体pET30a中，并转化至BL21（DE3）中。经PCR鉴定阳性的菌液通过IPTG诱导，表达氨基端带6个连续组氨酸残基的Rv2450c蛋白，并纯化。结果获得了结核分枝杆菌复苏因子Rv2450c基因，构建了重组表达质粒，得到融合了6个连续组氨酸残基的Rv2450c蛋白，纯度〉90％。结论应用基因重组表达技术表达结核杆菌复苏因子蛋白，可为下一步摸索临床标本结核分枝杆菌复苏培养及复苏基因的功能研究打下一个良好的基础．

复苏促进因子Rpf增效处理磺胺二甲嘧啶废水的研究

目的:微生物是降解磺胺类抗生素(sulfonamides,SAs)的主要驱动者,但在抗生素胁迫下易处于活的非可培养状态(viable but non-culturable,VBNC)而无法筛选得到;利用藤黄微球菌产生的复苏促进因子(resuscitation-promoting factor,Rpf)改善VBNC降解菌群的生长繁殖特性,提高废水的抗生素去除效果。方法:以磺胺二甲嘧啶(sulfamethazine,SMZ)废水为处理对象,利用Rpf蛋白的复苏作用驯化SMZ废水处理系统内活性污泥中潜在的功能降解菌群。结果:当SMZ质量浓度为0.5 mg/L时,投加Rpf蛋白后,SMZ的去除率提高了9.38%;当SMZ质量浓度增加到20 mg/L时,SMZ的去除率提高了17.10%;高通量测序结果表明,Rpf蛋白的投加主要促进了与SMZ降解相关的归属于变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidota)的unclassified_f_Comamonadaceae、OLB8、Shinella和Rhodococcus等在系统内的富集,进而提高了SMZ去除效果。结论:首次利用Rpf强化微生物降解SMZ废水,为Rpf应用于其他磺胺类抗生素的去除提供了理论基础。

水体消毒过程中活的不可培养细菌的形成与复苏机制研究进展

在传统水体消毒技术刺激下,细菌会进入活的不可培养(viable but nonculturable,VBNC)状态来提高自身存活率。在撤去外部压力时,未被消毒技术完全去除的VBNC细菌可在水储存和分配期间发生一定程度的复苏,而这些复苏的细菌很可能进入人体并导致严重疾病。然而,目前仍不清楚水体消毒过程中活的不可培养细菌的形成与复苏机制。该文通过检索了95篇相关文献并结合课题组在抗生素耐药菌方面的消毒控制和细菌休眠方面的研究进行了系统分析。首先,介绍了在不同水消毒技术下VBNC细菌的形成并阐述了其潜在的形成机制,其主要包括了严谨反应、能量代谢、一般应激反应系统和毒素-抗毒素系统。其次,介绍了VBNC致病菌复苏的风险和总结了13种复苏方法。该文还综述了自然复苏、复苏促进因子(Rpf)与自诱导剂复苏等3种复苏机制的不同。在修复了细胞损伤并恢复氧化还原平衡和代谢活性之后,VBNC细菌才能发生自然复苏。Rpf能够帮助VBNC细菌重塑细胞壁,这有助于VBNC细菌恢复可培养能力。自诱导剂-2能够促进微生物种群中的细胞间通讯并增加katG的表达来降低过氧化氢毒性,从而促进VBNC细菌的复苏。最后,对今后的研究方向进行了展望,介绍了微流控技术、稳定同位素示踪代谢活性分析方法、单细胞重水标记拉曼光谱方法和荧光能量共振转移技术等可以用于研究VBNC细菌复苏机制的前沿技术。该综述能为回答“多大剂量的消毒技术能够灭活VBNC细菌并避免其复苏”和“复苏的VBNC细菌生理特性是否都恢复到正常水平”等问题提供参考,为水处理过程中微生物安全性评估和制定更有效的消毒策略提供理论依据。

复苏促进因子辅助单细胞分离筛选青藏高原低温联苯降解潜力菌

微生物资源的挖掘一直是研究关注的重点.在传统微生物分离培养中,因优势菌群竞争及培养条件限制等原因,存在庞大的不可培养微生物群体,单细胞分离培养可排除种间竞争的影响,添加复苏促进因子蛋白可提高低活性、慢生长微生物的分离效率.青藏高原拥有着巨大的微生物资源储备量,同时也因为脆弱的生态环境而受到原油、持久性有机污染物等的威胁,在高原长期的低温条件下,挖掘本土微生物资源对冷环境污染修复具有重要意义.本研究利用单细胞分离与复苏促进因子添加培养相结合的方法,从青藏高原不同海拔表层土壤样品中,分离培养低温联苯降解潜力菌,并探究分离菌株对复苏促进因子的响应情况.共获得24株可在低温条件下以联苯为唯一碳源生长的菌株,其中18株来自复苏促进因子添加组,分属于Microbacterium等9个属,多数筛选菌株对复苏促进因子的响应明显.本研究建立了一种新的功能菌分离筛选方法,具有高效率、低成本、易推广的特点,为“微生物暗物质”挖掘提供了一种新方案.

骨关节结核脓液中结核杆菌的复苏培养

目的探讨骨关节结核脓液中结核杆菌的复苏培养方法。方法应用含不同浓度复苏因子蛋白的7H9液体培养基培养标本，分别在第6天、第11天、第16天、第30天检测培养物的OD值、取10uL涂7H11平板培养、抗酸染色，并同时将标本进行罗氏培养和涂片抗酸染色。结果复苏培养阳性率高于涂片阳性率和罗氏培养阳性率．二者均有统计学显著差异（P〈0．05）；复苏培养平均在第10天进入对数生长期，其OD值与对照组比较有显著性差异（P〈0．01）。结论结核杆菌复苏因子能有效地促进骨关节结核脓液中结核杆菌的生长。

VBNC菌群中好氧反硝化菌种的复苏培养及其脱氮特性

高氨氮废水的生物处理技术因安全高效而备受关注,但反硝化细菌的分离菌源仅限于常规分离培养法所获得的不到1%的微生物,绝大多数菌株因处于活的但非可培养(“viable but non-culturable”,VBNC)状态而未能被发掘。复苏培养VBNC菌群对强化高氨氮废水的生物处理具有重要意义。本文利用复苏促进因子复苏培养高氨氮废水中的VBNC菌株,16S rRNA基因测序对其进行同源性分析,初步鉴定复苏培养的菌株归属于Gordonia和Pseudomonas属。通过测定特殊培养基中硝态氮、亚硝态氮和氨氮的浓度,研究VBNC菌株的好氧反硝化性能,其中,菌株ZYR51的好氧反硝化能力较强。本研究为挖掘潜在具有好氧反硝化性能的VBNC菌种提供了新方法,并为筛选高效去除高氨氮废水的菌种资源提供了新思路。

细菌非可培养状态复苏方法的研究进展

细菌在不良环境胁迫下仍保持新陈代谢活性和毒性,但会失去在常规培养基上生长繁殖能力而进入活的非可培养状态(visablebut nonculturable state,VBNC)。处于VBNC状态下的细菌,包括很多病原菌,在一定的条件下可复苏并重新获得可培养能力。这为人类对未知微生物资源的开发和利用提供了新的方向,同时对公共健康安全和食品安全的监督与防控提出了全新的挑战。文中综述了VBNC细菌的复苏方法,并分析了其潜在的复苏机制,旨在为今后的研究提供更多的研究思路。

复苏促进因子结合蛋白A的原核表达及对耻垢分枝杆菌的促生长作用

目的:在大肠埃希氏菌中表达结核分枝杆菌复苏促进因子结合蛋白A(resuscitation-promoting factor-interacting protein A,RipA),观察该蛋白对耻垢分枝杆菌的促生长作用。方法:采用PCR方法,从结核分枝杆菌H37Rv的DNA中扩增出编码RipA蛋白的Rv1477基因,测序正确后克隆入原核表达载体pProEx HTa,构建重组表达质粒pProEx HTa-RipA。以重组质粒转化大肠杆菌DH5a,筛选阳性重组菌株,经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside IPTG)诱导RipA表达,在变性条件下对目的蛋白进行亲和层析纯化。将纯化的RipA蛋白加入到耻垢分枝杆菌中,分光光度法测定细菌的A600,观察RipA蛋白的促生长作用。结果:成功扩增了Rv1477基因,并克隆于表达载体pProEx HTa中,经酶切鉴定获得阳性克隆。经诱导在大肠杆菌中表达出相对分子量为52kDa的目的蛋白,Western-blot结果显示该蛋白与6×His单抗有特异性的反应条带。采用Ni+-NTA柱可获得纯化的目的蛋白。100pM的RipA蛋白可显著促进耻垢分枝杆菌休眠菌的复苏和生长。结论:RipA蛋白在大肠杆菌中成功表达,并能有效促进耻垢分枝杆菌的生长。

来源于Micrococcus luteus的复苏促进因子异源表达及其对活性污泥中休眠细菌的促生长作用

【背景】复苏促进因子(Resuscitation promoting factor,RPF)是由某些放线菌分泌的一类活性蛋白质,最初在Micrococcusluteus中被发现。它不但能够复苏休眠细菌恢复生长,而且对正常的细菌也有促生长效果。然而关于RPF对于环境样品中除原始宿主以外细菌的复苏促进作用研究还鲜有报道。【目的】以寻找新的菌种资源、开发环境功能菌角度研究了RPF对环境样品中潜在休眠菌群的复苏促进作用。【方法】首先对来源于Micrococcus luteus IAM 14879的RPF(Ml RPF)蛋白序列进行生物信息学分析和同源模建;随后克隆了Ml RPF编码基因并在大肠杆菌中异源表达;最后利用重组Ml RPF对活性污泥样品中潜在的休眠细菌开展了复苏促生长研究。【结果】Ml RPF在进化树上处于单独分支,远离其它RPF家族成员;模建结构分析表明Ml RPF具有与C型溶菌酶相似的催化结构域,这有助于解释RPF家族蛋白具有溶解酶活性;重组Ml RPF在大肠杆菌中获得了可溶性表达,它能够促进休眠态M. luteus IAM 14879生长,保留了其生理活性;利用重组Ml RPF从某污水厂活性污泥样品中分离获得了Dietzia、Paracoccus、Rhodococcus和Brevundimonas菌株。【结论】为环境样品中微生物多样性研究及特殊微生物资源的发掘提供新的方法,也为基于Ml RPF的废水生物强化处理技术研发提供理论依据。

红平红球菌复苏促进因子基因克隆及功能域分析

复苏促进因子（Rpf）广泛存在于高G＋C含量的革兰氏阳性细菌中,与细菌生长及抵抗不良环境有关,不同细菌Rpf种类和数量有一定差异。红平红球菌（Rhodococcus erythropolis）KB1分离自石油污染土壤,具有高效石油降解能力和环境适应性。为探索Rpf在红平红球菌KB1适应环境过程中作用,设计了复苏因子基因特异引物,从红平红球菌KB1基因组DNA扩增出4种rpf基因。序列分析发现4种基因分别与藤黄微球菌（Micrococcus luteus）rpf基因,结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）rpfB、rpfC及链霉菌（Streptomyces coelicolor）rpfB相似性较高。4个rpf基因编码蛋白都有一个类似Mt细胞复苏促进因子Rpf域,由大约70个氨基酸组成。其中Rpf-1与结核分枝杆菌、链霉菌RpfC相似,只含1个Rpf结构域;Rpf-2与结核分枝杆菌RpfB相似,含有1个Rpf域、1个G5域和2个DUF348;Rpf-3与链霉菌RpfB相似,含有1个Rpf域、G5域和3个DUF348;Rpf-4与藤黄微球菌Rpf相似,含1个Rpf域和1个LysM域。Rpf-2、Rpf-3含信号肽序列,Rpf-1、Rpf-4不含信号肽。

Rpf蛋白:一种激活休眠状态放线菌的复苏促进因子

放线菌能产生多样性丰富的小分子化合物,但大多数放线菌因为处于"活的尚未培养"状态而无法分离培养。造成"活的尚未培养"状态的原因之一可能是由于一些环境因素,例如有机物、重金属、抗生素等胁迫使细胞处于休眠保护状态,直到遇到适宜的条件才能继续复苏生长。复苏促进因子(Resuscitation-PromotingFactor,Rpf)是由某些放线菌分泌的一类蛋白质,首次在藤黄微球菌(Micrococcus luteus)中发现,之后人们对Rpf蛋白的功能和分布给予了更多的关注。Rpf蛋白能促进一些休眠的革兰氏阳性细菌复苏,这为"活的尚未培养"放线菌的分离培养提供了可能性。同时,针对一些致病放线菌物种,开发Rpf蛋白抑制物为相关疾病的治疗也提供了一条新的途径。基于此,本文对Rpf蛋白的结构组成、特征功能、作用机制及应用前景进行了简要的概述。