夏氏疟原虫感染早期易感和抵抗小鼠树突状细胞亚群和表型的变化特点

目的探讨夏氏疟原虫（Plasmodium chabaudi chabaudi AS）感染早期,树突状细胞（Dendritic cells,DCs）亚群和表型的变化特点。方法感染易感的DBA/2和抵抗的BALB/c小鼠,制备感染前和感染后第3、5、8d小鼠脾细胞悬液,采用流式细胞分析技术检测2种小鼠脾细胞悬液中髓样DCs和浆样DCs的数量以及表面表达MHC Ⅱ类分子和CD80分子的DCs的百分含量。结果 DBA/2小鼠和BALB/c小鼠分别呈现以髓样DCs和浆样DCs为主的增殖模式。2种小鼠表达MHCⅡ类分子和CD80分子的DCs数量在感染后3~5d明显升高,并于感染后第8d达到最高水平,然而感染后第8d,BALB/c小鼠表达MHCⅡ类分子和CD80分子的DCs的数量明显低于DBA/2小鼠。结论感染早期,DBA/2和BALB/c小鼠在DCs亚群的增殖模式、成熟表型特征性分子的表达水平上存在显著差异。

CD4^+CD25^+Foxp3^(hi)细胞在夏氏疟原虫感染DBA/2小鼠作用研究

利用调节性T细胞消除的致死型夏氏疟原虫(Plasmodium chabaudi chabaudi AS,P.c chabaudi AS)感染鼠疟模型,探讨DBA/2小鼠对P.c chabaudi AS感染易感性的原因。DBA/2小鼠对P.c chabaudi AS易感,伴随原虫血症增加CD4+CD25+Foxp3+细胞数量明显增加,且以CD4+CD25+Foxp3hi增加更为明显。原虫血症达峰值时CD4+CD25+Foxp3hi细胞数量亦达到峰值。相比,Treg消除鼠的原虫出现时间和疟血症峰值时间均明显延迟,且在疟血症达峰值前(5～8 d)原虫血症水平明显低于对照组。与之相应,CD4+CD25+Foxp3hi细胞数量明显处于低水平。同时,Treg消除鼠生存期明显延长。由此提示,P.c chabaudi AS感染导致Foxp3表达增加,扩增的CD4+CD25+Foxp3hi细胞有利于疟原虫复制和逃避宿主免疫应答,进而影响疟疾感染的进程和最终结局。

致死型夏氏疟原虫感染BALB/c小鼠CD4^+ CD25^+ Foxp3^+调节性T细胞在Th2免疫应答极化中的作用研究

为探讨CD4+ CD25+ Foxp3+调节性T细胞(Treg细胞)在疟疾感染过程中对Th2极化的调控作用,利用Treg细胞消除的致死型夏氏疟原虫(Plasmodium chabaudi chabaudi AS,P.c chabaudi AS)感染鼠疟模型进行研究。结果显示,对照组小鼠在感染后8 d原虫血症达到峰值40.5%,随后迅速下降,于感染后18 d小鼠自愈。相比,Treg细胞消除组于感染后10 d,原虫血症水平迅速上升至32%,随后小鼠相继死亡。在感染后8～10 d,Treg细胞消除小鼠脾脏CD4+ CD25+ Foxp3+细胞占CD4+细胞百分比含量明显低于对照组。同时,血清疟原虫特异性抗体IgG1和IgG2a水平均明显降低。结果提示,P.c chabaudi AS感染中CD4+ CD25+ Foxp3+细胞参与调控Th2型免疫应答的极化,进而干预疟原虫清除。

旋毛形线虫预感染对夏氏疟原虫感染BALB/c小鼠Th细胞变化的影响

为研究预感染旋毛形线虫后BALB/c小鼠抵御夏氏疟原虫攻击感染的能力,实验组(TPC)分别在小鼠感染旋毛形线虫1 w(TPC1)和3 w(TPC3)后感染夏氏疟原虫,对照组(PC)单独感染夏氏疟原虫,观察小鼠原虫血症及体重的变化,并采用Real-Time RCR扩增法分析转录因子T-bet和Gata-3表达水平的消长。与PC组相比,TPC1组原虫血症峰值降低,T-bet表达水平升高,Gata-3表达水平降低;TPC3组原虫血症出现时间推迟,峰值升高,T-bet表达水平降低,Gata-3表达水平升高;TPC组体重均下降,TPC组与PC组均于感染后25 d左右自愈。旋毛虫预感染使小鼠对疟原虫的抗感染能力增强,但混合感染并不影响宿主最终清除疟原虫的能力。

夏氏疟原虫感染过程中调节性B细胞的表达变化

调节性B细胞(regulatory B cells,Bregs)是近年来发现的通过分泌IL-10发挥免疫调节作用的B细胞,其在疟疾免疫应答中的作用尚不清楚。利用血液阶段夏氏疟原虫(Plasmodium chabaudi AS,P.c AS)感染的BALB/c小鼠,观察了感染过程中Bregs数量变化及其表面分子表达情况。结果显示,BALB/c小鼠感染P.c AS后红细胞感染率逐渐升高,于感染后第9天达到30%,多数小鼠死亡。脾组织细胞因子IL-10 mRNA水平在感染后显著升高,感染后第5天达到高峰,感染后第8天仍为正常小鼠的10倍左右。CD4+细胞中IL-10+细胞百分比和绝对数量在感染后第5天达到峰值,于感染后第8天回落至正常水平;而CD19+细胞中IL-10+细胞(Bregs)百分比在感染后持续上升,在感染后第8天达到CD19+细胞的5%左右;感染后第5天,脾中CD4+IL-10+细胞绝对数量高于CD19+IL-10+细胞,至感染后第8天,CD19+IL-10+细胞绝对数量显著高于CD4+IL-10+细胞(P﹤0.01),约90%Bregs为CD5-细胞。结果提示,P.c AS感染过程中Bregs显著活化,是感染1周后IL-10的主要产生细胞。

CD4^+CD25^+T细胞在夏氏疟原虫感染鼠中的应答差异

为探讨CD4+CD25+调节性T细胞(Treg细胞)在夏氏疟原虫感染过程中的活化特点及其与疾病进展的相关性,用夏氏疟原虫分别感染BALB/c和DBA/2小鼠,Giemsa染色制备薄血膜,镜检计数红细胞感染率;以流式细胞术检测脾细胞悬液中Treg细胞百分含量;ELISA测定脾细胞培养上清IFN-γ水平。BALB/c小鼠原虫血症于感染后第8d达到峰值34.4%后迅速下降,于感染后第15d左右小鼠自愈;其IFN-γ水平和Treg细胞百分含量均在感染后第5d明显增加后开始下降(P<0.01);DBA/2小鼠原虫血症于感染后第9～11d一直维持在峰值38%左右,并在感染后约第10d小鼠死亡;其IFN-γ水平在感染后第3d明显升高后迅速回落(P<0.01),Treg细胞百分含量在感染后的前8d平稳升高,但于感染后第8～11d出现骤然上升。结果提示,CD4+CD25+调节性T细胞数量异常变化与宿主感染结局呈密切相关性。

夏氏疟原虫感染的红细胞膜表面抗原Pc90的cDNA特征 I．cDNA文库的构建及阳性克隆的筛选

目的：构建夏氏疟原虫早期滋养体的ｃＤＮＡ文库，并从中筛选出表达Ｐｃ９０的阳性克隆。方法：采用ＧＴＣ／ＣｓＣｌ法提取ＲＮＡ，ｃＤＮＡ克隆入λ－ＺＡＰ噬菌体，用抗Ｐｃ－ＨＣＰＭ血清３次筛选并经抗Ｐｃ９０单克隆抗体复筛，阳性克隆经体内剪接后行限制性内切酶酶切分析。结果：该ｃＤＮＡ文库有１．９×１０６个重组体。用抗Ｐｃ９０－ＨＣＰＭ的多克隆抗体筛选后，得到１６个阳性克隆，其长度分别为：０．６ｋｂｐ，１．４ｋｂｐ，１．６ｋｂｐ，２．２ｋｂｐ以及２．５ｋｂｐ。其中仅２．２ｋｂｐ和２．５ｋｂｐ克隆与抗Ｐｃ９０单克隆抗体反应呈阳性。限制性内切酶酶切分析表明，２．２ｋｂｐ，２．５ｋｂｐ和１．６ｋｂｐ的克隆具有不同的特征。结论：２．２ｋｂｐ和２．５ｋｂｐ的克隆极有可能表达Ｐｃ９０蛋白。

夏氏疟原虫感染早期易感和抵抗小鼠树突状细胞细胞因子的分泌特点

目的探讨在夏氏疟原虫(Plasmodiumchabaudi chabaudi AS,P.c.chabaudi AS)感染早期,树突状细胞(Den-dritic cells,DCs)调控Th1细胞免疫应答的相关机制。方法用P.c.chabaudi AS感染易感型DBA/2和抵抗型BALB/c小鼠,计数红细胞感染率;感染前和感染后3、5、8d制备脾细胞悬液,磁珠分选、纯化DCs并体外培养;ELISA方法检测DCs培养上清中IL-12p40、IL-10和TGF-β1的水平。结果 DBA/2小鼠DCs培养上清中IL-12p40的水平在感染后3-8天明显升高,BALB/c小鼠DCs培养上清中IL-12p40的水平在感染后5-8d出现有意义的升高,但其水平均明显低于DBA/2小鼠;两种小鼠DCs培养上清中IL-10与TGF-β1的分泌水平在感染后5-8d明显升高,但DBA/2小鼠DCs培养上清中IL-10与TGF-β1的分泌水平明显低于BALB/c小鼠。结论 P.c.chabaudi AS感染早期,DBA/2和BALB/c小鼠在DCs细胞因子的分泌模式上存在显著差异。

夏氏疟原虫感染的红细胞膜表面抗原Pc90的cDNA特征 Ⅱ．免疫阳性克隆Pc90-1的DNA序列分析及其在大肠杆菌中的表达

目的：对表达Ｐｃ９０的ｃＤＮＡ克隆进行鉴定和分析并在大肠杆菌中予以表达。方法：将２．５ｋｂｐ的克隆（Ｐｃ９０－１）分别双向经外源性核酸酶Ⅲ删除，以制备亚克隆，末端终止法测序，并在大肠杆菌中表达。结果：经ＤＮＡ序列分析，这个克隆全长２５８１ｂｐ，翻译大约６１ｋＤａ的蛋白（５３２个氨基酸），开放阅读框到１５９６ｂｐ，随后是２个连续的终止码。值得注意的是３－末端的非翻译区相对较长。Ｐｃ９０－１在第１００到３５５个氨基酸之间有一个明显的重复区。将Ｐｃ９０－１的各亚克隆在大肠杆菌中表达，仅得到一约３５ｋＤａ的融合蛋白。Ｐｃ９０－１的ＤＮＡ序列与其它已知序列无同源性。Ｐｃ９０－１的酸性等电点及潜在的磷酸根结合位点均与前人报道的Ｐｃ９０的特征相符。结论：Ｐｃ９０－１可能表达Ｐｃ９０蛋白。

夏氏疟原虫肝脾组织低温冰箱保种的初步试验

将无冰冻保护剂的含夏氏疟原虫（ＰｌａｓｍｏｄｉｕｍＣｈａｂａｕｄｉ）的小鼠肝、脾组织置－４℃、－２６℃和－７６℃冰箱作疟侯虫保种试验。保存于一４℃２ｄ的疟原虫尚能复苏使小鼠感染，保存于一２６℃，１６２ｄ和－７６℃２００ｄ的肝脾组织疟原虫，复苏接种健康小鼠其感染的阳性率分别为６０％和１００％，受染小鼠的血内原虫多在６ｄ－８ｄ出现。实验结果表明，本法保存红内期疟原虫方法简便，效果稳定可靠，保种期长，为一般实验室提供了一种疟原虫保种新方法。

CSF1/CSF1R信号在控制夏氏疟原虫再燃中的作用及机制初探

目的 探究集落刺激因子1(colony stimulating factor 1, CSF1)/集落刺激因子1受体(colony stimulating factor 1receptor, CSF1R)信号在控制夏氏疟原虫(Plasmodium chabaudi, P. chabaudi)再燃中的作用,并对其作用机制进行初步探讨。方法ELISA检测P. chabaudi感染不同时间小鼠血清CSF1浓度变化;随后采用CSF1及CSF1R体内抗体中和实验,观察CSF1/CSF1R信号在控制夏氏疟原虫再燃中的作用;最后通过流式细胞术观察CSF1/CSF1R信号作用的可能效应细胞。结果 与未感染小鼠相比,P. chabaudi感染小鼠血清CSF1浓度随感染时间的延长而逐渐升高,并在再燃阶段达到最高水平。在体分别中和CSF1或CSF1R后,感染小鼠再燃阶段的原虫血症显著增高;虽然固有免疫细胞表面CSF1R的表达不随感染升高,但中和CSF1和CSF1R后能显著降低感染小鼠脾脏非经典单核细胞(non classical monocytes, NCMs)和红髓巨噬细胞(red pulp macrophages,RPMs)频率(P<0.05)。结论 CSF1可能通过作用于NCMs和RPMs细胞表面的CSF1R来维持其细胞数目,从而在控制夏氏疟原虫再燃中发挥重要作用。

夏氏、伯氏鼠疟原虫实验感染状况比较

用夏氏、伯氏疟原虫血传感染小鼠，采尾血制薄血片，姬氏染色，计１万个红细胞内疟原虫感染数。结果不同虫种同等数量或同虫种不同数量原虫其红细胞感染率不同，均有高度显著性差异。昆明鼠对夏氏疟原虫不敏感；对伯氏疟原虫敏感度高，易接种成功。血传伯氏疟原虫以１０５红细胞感染数为宜，其红细胞感染率高，原虫密度上升速度较快，动物不易死亡。

BALB/c小鼠感染不同疟原虫CD4^+ Th应答和凋亡特点的比较研究

探讨不同疟原虫感染BALB/c小鼠的免疫应答特点。BALB/c小鼠经腹腔注射致死型约氏疟原虫(P.y17XL)和夏氏疟原虫(P.cAS)感染的红细胞,计数红细胞感染率;ELISA动态检测感染小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ和IL-4水平;流式细胞术检测脾中CD4+T细胞凋亡数量。约氏疟原虫(P.y17XL)感染早期,小鼠原虫血症持续上升;IFN-γ和IL-4分泌水平仅在感染后第3天出现一过性有意义的升高,而且峰值较低;脾中CD4+T细胞大量凋亡,小鼠全部死亡;而夏氏疟原虫(P.cAS)感染小鼠,原虫血症上升缓慢;IFN-γ分泌水平在感染后第5天达峰值;IL-4分泌水平在感染后第10天达峰值,且峰值较高维持时间较长;脾中CD4+T细胞凋亡细胞于感染后8 d出现有意义升高,小鼠全部存活。抗疟保护性免疫有赖于Th1和Th2型免疫应答的有效建立和协调过渡,感染期间CD4+T细胞凋亡的时相和数量可能是影响免疫应答的强度或引起宿主免疫抑制的原因,从而影响宿主疟原虫感染的结局。

DBA/2小鼠感染不同疟原虫Th应答特点的比较研究

目的:探讨不同疟原虫感染DBA/2小鼠的免疫应答特点。方法:DBA/2小鼠经腹腔注射致死型约氏疟原虫(P.y17XL)和夏氏疟原虫(P.c AS)感染的红细胞,计数红细胞感染率;ELISA动态检测感染小鼠脾细胞培养上清中IFNγ-和IL-4水平;采用RT-PCR动态检测脾细胞中Th1和Th2型转录因子T-bet和GATA3 mRNA表达量。结果:两种疟原虫感染小鼠在感染早期T-bet mRNA表达量均明显增加,升高幅度明显高于GATA3,T-bet/GATA3比值明显高于感染前水平;IFNγ-明显升高后伴随IL-4分泌水平增加。但是,P.c AS感染小鼠IFNγ-水平明显高于P.y17XL感染小鼠,且随后的IL-4水平仅出现短暂升高,感染后前8天T-bet/GATA3比值未有明显下降趋势,原虫血症逐渐升高至小鼠全部死亡。相比,P.y17XL感染小鼠T-bet/GA-TA3比值在感染后第3天达峰值,随后缓慢下降但仍高于对照组,原虫血症得到控制至小鼠自愈。结论:抗疟保护性免疫不仅依赖于Th1和Th2型免疫应答的有效建立和协调过渡,而且Th1/Th2型免疫应答的发生时相和效应强度可能影响着疟疾感染的最终结局。

寄生虫病

0201198 世界卫生组织赢得了对DDT抗疟疾的暂时解脱/Kapp C∥Lancet.-2000,356(9247).-2076 医科图0201199 疟疾感染中细胞因子的作用[日]/平山谦二∥临免.-2001,35(1).-30～37