牙鲆(Paralichthys olivaceus)抗缪勒氏管激素Ⅱ型受体基因(amhr2)表达特征分析及功能初探

抗缪勒氏管激素Ⅱ型受体(anti-Müllerian hormone receptorⅡ,Amhr2)是抗缪勒氏管激素(anti-Müllerian hormone,Amh)的特异受体。amhr2基因在鱼类性腺分化和发育中发挥重要作用,更决定了有的鱼种的性别,然而,相关功能研究较为有限。本研究旨在明晰amhr2在我国重要海水养殖鱼类—牙鲆(Paralichthys olivaceus)性腺分化和发育过程中的表达特征,并初步探究其功能。首先,克隆了牙鲆amhr2-CDS序列,共1536bp,编码511个氨基酸。系统发育分析显示牙鲆Amhr2近C端较为保守,与其他硬骨鱼类聚为一枝,并与上游sp1以及下游的prr13和PCBP2在基因组中共定位。蛋白结构分析显示,牙鲆Amhr2包含信号肽、跨膜结构域和保守的酪氨酸蛋白激酶结构域。进而,利用实时荧光定量PCR(q PCR)分析表明,牙鲆amhr2主要表达于性腺,且在精巢中的表达极显著高于卵巢(P<0.01),其在I-V期精巢中持续高表达,而在卵巢中仅在I期高表达,后显著下降(P<0.05)。性腺分化期基因的表达,是对雌核发育组(对照组,20±0.5℃,100%雌性)与雌核发育高温诱导组(HT组,28±0.5℃,100%雄性)鱼苗进行检测的,amhr2在对照组全长(totallength,TL)2cm的实验鱼性腺中表达最高,后逐渐下降;而HT组实验鱼性腺中的表达呈现先上升后下降的趋势,并在精巢开始分化的6cm TL时表达最高。利用Hela细胞进行亚细胞定位分析发现,Amhr2与其配体Amh均定位于细胞质。同时,通过原核表达重组牙鲆Amh,并用其孵育离体性腺组织,q PCR分析显示精巢中amhr2的表达没有显著变化,但卵巢中表达显著上升(P<0.05)。进一步通过双荧光素酶报告分析表明,Amh和Amhr2共转染能够显著抑制雌激素合成的关键芳香化酶基因cyp19a的表达(P<0.01)。综上所述,牙鲆amhr2主要表达于精巢,但在不同性腺发育时期表达不同,且其可能与Amh共同影响cyp19a的转录,对雄性表型形成的启动和性腺发育起作用。

夏牙鲆(♂)与牙鲆(♀)人工杂交的细胞遗传学初步研究

于2004年11～12月在青岛薛家岛养鱼场采用夏牙鲆(Paralichthysdentatus)的精子与牙鲆(Paralichthysolivaceus)的卵子实施了多次人工杂交实验,并进行了父本母本鱼类个体、子代的染色体制片观察和细胞中DNA相对含量的流式细胞仪检测。结果表明,夏牙鲆染色体数为48,核型为2n=48t、臂数NF=48;子代的染色体数和核型与父母本的一样,也为2n=48t;子代的细胞中DNA的相对含量也表明其为二倍体。因此,可以明确其为杂交的后代,而不是雌核发育。

渗透压、pH、葡萄糖及离子溶液对夏牙鲆精子激活及运动特征的影响

作者通过渗透压计分别测定各溶液的渗透压值,通过CASA精子分析系统,测定精子运动参数,分析、比较了渗透压、pH、葡萄糖及离子溶液对夏牙鲆(Paralichthys dentatus)精子激活及运动特征的影响。结果表明:夏牙鲆精子激活的渗透压范围为581~1260 mosm/kg;在特定的渗透压范围内(单位为mosm/kg),A组(581~650),B组(762~877),C组(931~1060),D组(1117~1260)中,与NaCl和KCl溶液相比较,葡萄糖溶液可以显著提高夏牙鲆精子激活后的运动率;在相对高渗条件下(1091~1180),经Ca Cl2400、EGTA400和无Ca^(2+)人工海水激活的夏牙鲆精子运动率存在显著差异;且夏牙鲆精子最适的激活p H范围是7~7.5。综上,激活剂的渗透压决定了夏牙鲆精子能否激活并显著影响了激活后精子的运动率,同时葡萄糖、外源Ca2+及p H均在一定程度上影响了精子的运动率。

杂交鲆(牙鲆♀×夏鲆♂)胚胎发育的初步观察

通过人工调控促使亲本牙鲆（Paralichthys olivaceus）♀×夏鲆（Paralichthys dentatus）舍的性腺发育，人工干法授精获得杂交受精卵。杂交受精卵在温度为16．5～17．5℃，光照为100-400lx，微充气条件下孵化。对杂交鲆胚胎发育全过程进行连续观察并与牙鲆度夏鲆的胚胎发育进行比较。结果表明：杂交鲆卵裂方式与其他大部分硬骨鱼类一样，属于盘状卵裂。受精后经过2h30min进入2细胞期，7h45min进入囊胚期，15h10min进入原肠胚阶段，25h30min进入神经胚期，49h左右进入尾芽期。授精后63h左右发现初孵仔鱼，68h左右50％的仔鱼孵出。在杂交鲆的胚胎发育中，主要有2个发育特征与母本类似而与父本不同：视囊的出现要早于体节的分化；孵化前，仔鱼在卵膜内环绕卵黄囊不到1周。但是在其孵化时间上却与父本相似。

牙鲆与夏鲆杂交及回交子代胚胎发育及早期生长比较

通过人工授精技术对牙鲆（Paralichthysolivaceus）和夏鲆（Paralichthysdentatus）进行了正反交及回交实验，并比较了正反交、回交子代的胚胎发育时序和仔稚幼鱼的生长。结果表明：孵化水温18．0±0．5℃下，初9阵仔鱼破膜用时为：牙鲆41h，正交鲆47h，回交牙鲆42h30min，回交夏鲆44h：16．5±0．5℃下，夏鲆61h40min，反交鲆66h。正交及两组回交子代在胚胎期均可正常发育。反交子代卵裂期出现异常，仅少数胚胎可以孵化。胚胎孵化后，在1～64日的培养过程中，反交鲆于3-4d内全部死亡，回交牙鲆发育至18日龄时全部死亡。正交鲆和回交夏鲆可正常发育，与牙鲆没有明显差别。

褐牙鲆(♀)、夏鲆(♂)及其杂交子一代线粒体16S rDNA序列遗传特性的初步研究

以线粒体16S rRNA基因部分片段为代表研究雌褐牙鲆Paralichthys olivaceus、雄夏鲆P. dentatus及其杂交子一代间线粒体DNA的遗传特性。母本与父本序列差异较大,属种间差异,在590个位点中有28个变异位点,而且全部为简约信息位点。使用同一对引物扩增亲本与杂交子代,在杂交子代中未检测到父本的线粒体DNA类型,11个处于两种生长阶段的杂交样本仅检测到一种单倍型,而且与母本的一个单倍型为同一种,表明褐牙鲆与夏鲆杂交线粒体DNA遵循母系遗传规律。

显微注射抗冻剂对牙鲆(Paralichthys olivaceus)胚胎毒性及冷敏感性的影响

在鱼类胚胎冷冻保存中,由于胚胎体积大、卵膜具多层结构,并且通透性差,传统的平衡法无法使抗冻剂足够、有效的进入胚胎内部起到保护作用。为弥补了普通平衡法的不足,此研究利用显微注射技术,将抗冻剂直接注射到鱼类胚胎卵黄囊内,提高了抗冻剂对胚胎的保护程度。此研究以牙鲆胚胎为试验材料,对显微注射抗冻剂种类、抗冻剂的注射剂量、注射浓度、以及抗冻剂注射后胚胎的冷敏感性影响进行了筛选。结果表明:牙鲆胚胎较适宜的显微注射剂量为750pl;几种抗冻剂注射牙鲆胚胎后的毒性大小相对排列为PVP>蔗糖,DMSO>MeOH>PG,其中注射PG获得的胚胎成活率和孵化率最高,注射PVP获得的胚胎成活率和孵化率最低,而PG与MeOH组成混合抗冻剂PM毒性更低获得的胚胎成活率和孵化率更高。而任何一种抗冻剂均随着浓度的增加其毒性随之增加;另外,在冷敏感试验中,显微注射6mol/L的PM的胚胎胚胎,应用程序化法处理,以2℃/min的速率由室温降至-20℃,平衡10min后解冻处理,发现注射PM的胚胎低温处理后成活率为(25.07±1.57)%,而6mol/的PM五步平衡法同步处理的对照组胚胎成活率为(20.88±2.84)%,说明显微注射的胚胎冷敏感性一定降低。

褐牙鲆、夏鲆及其杂交子代核型与DAPI带型分析

为了深入剖析褐牙鲆与夏鲆杂交后代的染色体结构,本研究利用秋水仙素-低渗-空气干燥法制备胚胎染色体和DAPI(4’,6’-diamidino-2-phenylindole)荧光染色的方法,对褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)、夏鲆(Paralichthys dentatus)及其正反交子代胚胎细胞的染色体组型和染色质的分布进行了研究。结果表明,褐牙鲆、夏鲆及其正交子代(褐牙鲆♀×夏鲆♂)染色体组均含有48条端部着丝粒染色体,染色体组型公式均为2n=48t,组内染色体长度分布连续,三者核型相似。反交子代(夏鲆♀×褐牙鲆♂)为46条端部着丝粒染色体,比亲本及正交子代少了两条染色体。DAPI荧光染色显示,褐牙鲆1号染色体中的一条染色体有较明显的次缢痕,夏鲆及正反交子代染色体中未见明显次缢痕。褐牙鲆与正交子代染色体着色较为均一,而夏鲆与反交子代着丝粒区域亮度明显增强。

漠斑牙鲆(Paralichthys Lethostigma)苗种培育试验

为探索漠斑牙鲆的苗种培育技术 ,分别于 2 0 0 3年和 2 0 0 4年从美国引进漠斑牙鲆的初孵仔鱼进行鱼苗培育试验和淡化试验。试验获得了成功。 2 0 0 3年引进初孵仔鱼 4 .0万尾 ,培育出体长 4 5cm的鱼苗 2 2 5 0尾 ,鱼苗培育成活率为 5 .6 % ,其中前期和后期的培育成活率分别为 9.0 %和 6 2 .5 %。 2 0 0 4年引进初孵仔鱼 4 .5万尾 ,经培育共获得体长 4 5cm的鱼苗 2 830尾 ,培育成活率为 6 .3% ,其中前期和后期的培育成活率分别为 11.8%和 6 3.6 %。经过逐步淡化的鱼苗在纯淡水中生长良好。

台湾海峡野生牙鲆(Paralichthys olivaceus)亲鱼驯养和促熟产卵的探讨

本文研究了产自台湾海峡的野生牙鲆亲鱼的驯养、促熟和产卵。结果表明 ,活的鲻鱼苗可用于牙鲆的诱食 ;当水温达到 1 6 .2～ 1 9.5 ℃时 ,牙鲆可自然产卵 ,产卵盛期为 3月中旬至 4月上旬 ,4月份受精率高达 86 %。在驯养过程中亲鱼未发生死亡。

牙鲆“渡夏难”原因探讨及对策

牙鲆具有个体大、生长快、繁殖能力强等特点，并且肉质鲜美，市场价值高，是我国重要的海水养殖品种之一。目前，牙鲆的养殖区域主要在辽宁、山东等北方省份，在浙江、福建、广西等地也进行了繁育和养殖的尝试。但是，南方省份沿海水域地处亚热带，夏季水温较高，严重影响了牙鲆养殖的成活率。养殖试验表明：

南方养殖牙鲆安全渡夏技术

牙鲆Paralichthys olivaceus（Temincket Schlegel）俗称比目鱼，属鲽形目、鲆科、牙鲆属，为冷水性底栖鱼类。牙鲆生长温度2～32℃，适温范围8～25℃。牙鲆味道鲜美，市场价格高，销路广，逐渐成为名贵的重要海水养殖品种之一。我国的辽宁、河北、山东等省自上世纪90年代开始，牙鲆养殖发展迅速，取得了良好的养殖效益。近年来，南方各省市纷纷从北方引进苗种，或通过本地牙鲆人工育苗获得苗种进行养殖，已经形成热门的养殖优势品种。

舟山牙鲆Paralichthys olivaceus(Temminck et Schlegel)与虾蟹池塘混养技术初探

2003年～2005年在舟山市普陀区桃花镇1口29亩低产虾塘中进行了本地牙鲆与虾、蟹混表的试验,二年共产中国对虾2,800kg,三疣梭子蟹1,640kg,牙鲆1,100kg,总产值35.1万元,总利润20万元,取得了较好的经济效益;同时本地牙鲆首次在我市池塘养殖中安全渡夏越冬,证明了本地牙鲆在我市开展池塘养殖的可行性,为目前海水养殖结构调整,促进渔民增收,提供了一条新的途经,具有良好的社会效益。

夏牙鲆的引进与室内养成试验

2002年11月从美国引进夏牙鲆（Paralichthys dentatus）鱼苗2000尾，平均体长8.3cm，平均体宽3．6cm，平均体重8．26g，在室内长方形育苗池内试养，水温9～32℃，盐度20‰～28‰，通过投喂自制的湿颗粒饵料，控制水质，防治病害等措施，经过一年试养，夏牙鲆平均体长36．80cm，体宽15．77cm，体重达750g。本试验为室内池养殖夏牙鲆提供了有实用价值的技术资料。

一株牙鲆源哈维氏弧菌的分离鉴定及抗性研究

自秦皇岛昌黎养殖的患病牙鲆(Paralichthys olivaceus)体内分离获得一株革兰氏阴性菌,对其形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列进行分析,鉴定其为哈维氏弧菌(Vibrio harveyi);对分离菌株进行了30种抗菌药的药敏试验和11株益生菌的拮抗试验,得出此分离菌株对米诺环素、左氧氟沙星、头孢他啶、氟苯尼考、头孢曲松、诺氟沙星、环丙沙星、强力霉素、复方新诺明等13种药物高度敏感,对克林霉素、青霉素、氨苄西林、林可霉素、苯唑西林等9种药物表现为不同程度的耐药性;地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌2种益生菌在一定浓度下对其具有拮抗作用。

应用荧光抗体技术检测牙鲆体内的河流弧菌

用灭活的河流弧菌(Vibrio fluvialis)抗原,注射免疫实验兔,制得凝集价为1∶5 120的抗血清。用试管凝集法检测了抗血清的特异性,再用免疫吸附法去除交叉反应,从而得到高效价、高特异性的抗河流弧菌血清。用所制备的抗血清在实验室中建立起河流弧菌荧光抗体检测技术(FAT),在荧光显微镜下可清楚地看到被标记的病原菌,整个检测过程只需3h。用河流弧菌感染牙鲆(Paralichthys olivaceus),24 h后,用FAT测定牙鲆的血液、肾脏和肝脏中的河流弧菌,在血液中河流弧菌的检出率最高,其次是肾脏,肝脏的检出率最低。以上结果表明:荧光抗体技术可以快速、灵敏、准确地检测出牙鲆体内的河流弧菌。

牙鲆性腺分化的组织学研究

运用组织学方法对牙鲆（Paralichthys olivaceus）的性腺分化和发育过程进行了观察。结果表明，牙鲆的性腺发育可分为3个阶段，即原始性腺阶段、性腺分化阶段和性腺分化后阶段。培育水温为18℃～20℃下，孵化后第45天、平均全长为22．0mm±2．8mm的牙鲆，其性腺分化尚未开始，属于原始性腺。70日龄、平均全长为38．0mm±1．7mm的牙鲆，部分个体中观察到卵巢的雏形，其余个体中性腺变化并不大；到了第110天、平均全长达到86．5mm±5．9mm时，雌性个体卵巢的卵巢腔进一步增大，并出现卵原细胞向卵母细胞的转变。精巢的分化开始于90日龄、平均全长为63．5mm±3．4mm的幼鱼，此期精原细胞快速增殖，体细胞进行有丝分裂并逐渐形成输精管原基；进一步的细胞学分化则出现在100日龄、平均全长为76．0mm±8．6mm的个体中，此时可以看到精小叶的形成；在平均全长为140．0mm±15．2mm时，精巢中出现初级精母细胞，标志着性腺分化的基本完成。

牙鲆dmrt1基因的克隆及其与P450arom基因的组织表达分析

通过基因组步移和3’RACE获得了牙鲆(Paralichthys olivaceus)dmrt1的cDNA全序列,该基因开放阅读框全长909bp,其编码的蛋白具有高度保守的DM结构域,5’UTR区含有性别相关转录因子Sox9和Sox5的结合位点。牙鲆dmrt1基因只在牙鲆的性腺中表达,且在精巢中的表达明显高于卵巢,表明牙鲆的dmrt1可能是一种性别相关基因。同时,对牙鲆的另一性别相关基因P450arom在成体各组织的表达分析结果表明,该基因除在牙鲆的性腺中有表达外,在肾脏、脾脏、鳃和脑等其他组织中也有不同程度的表达。牙鲆P450arom基因在性腺中的表达也存在两性差异,其表达模式与dmrt1的正好相反,在卵巢中的表达量明显高于精巢。

喹诺酮类药物对牙鲆肝药物代谢酶活性的影响

以牙鲆(Paralichthys olivaceus)为研究对象,通过观察水产用的3种喹诺酮类药物(FQ)恩诺沙星、诺氟沙星和氟甲喹分别对牙鲆肝组织中氨基比林N-脱甲基酶(AND)、红霉素N-脱甲基酶(ERND)和7-乙氧基异吩唑酮-脱乙基酶(EROD)活性的影响,探讨喹诺酮类药物对牙鲆肝药物代谢酶(细胞色素P-450)活性影响的差异。结果表明,与对照组比较,三组喹诺酮类药物对牙鲆肝S9中AMND、ERND、EROD酶活性均具有抑制作用,其中恩诺沙星和诺氟沙星组中,3种酶的活性极显著下降(P<0.01),而对于氟甲喹组而言,AMND、ERND酶活性显著下降(P<0.05),EROD酶活性极显著下降(P<0.01)。

漠斑牙鲆养殖群体RAPD遗传多样性的初步分析

利用RAPD技术对由美国引进的漠斑牙鲆（Paralichthys lethostigma）齐殖子一代群体的遗传多样性进行了研究。实验用漠斑牙鲆鱼苗于2004年10月取自山东莱州大华水产有限公司，共24尾，全长平均为16．6mm±1．99mm。活体取其肌肉，用高盐法柚提获得总DNA，琼脂糖电泳检测，Beckman DU-6100型紫外分光光度仪定量后用随机引物进行PCR扩增，从25个随机引物中筛选出11个用于群体遗传学分析，共获得77条清晰重复性高的DNA片段，大小在100～2000bp之间，多态谱带比例和群体平均杂合度分别为66．23％和0．3526。