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人胰岛素原基因在大肠杆菌中高效外分泌表达 被引量:4
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作者 陈燕 李金照 +2 位作者 夏令朝 张瑛 李强 《生物化学杂志》 CSCD 1995年第6期636-641,共6页
将胰岛素原基因融合到金色葡萄球菌蛋白A的基因上,构建成大肠杆菌中基因融合的外分泌表达载体。它能高效表达且有效地分泌表达产物。利用亲和层析能方便地从培养液中分离出融合蛋白。融合蛋白经CNBr裂解后,经反相HPLC分析,... 将胰岛素原基因融合到金色葡萄球菌蛋白A的基因上,构建成大肠杆菌中基因融合的外分泌表达载体。它能高效表达且有效地分泌表达产物。利用亲和层析能方便地从培养液中分离出融合蛋白。融合蛋白经CNBr裂解后,经反相HPLC分析,分离得到具有天然结构的胰岛素原并进行了鉴定。 展开更多
关键词 胰岛素 胰岛素原基因 外分泌表达 大肠杆菌
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YebF作为载体蛋白所引导的重组蛋白胞外分泌表达途径的研究进展
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作者 郑晓芳 赵敏 《化学与生物工程》 CAS 2017年第6期6-11,共6页
大肠杆菌是表达重组蛋白最常用的宿主菌之一,但是由于它大多将重组蛋白分泌到菌体内部,导致重组蛋白不能正确折叠或者被降解而失去活性,使得目的蛋白的提取和纯化过程较为繁琐。解决这些问题的方法之一就是将重组蛋白分泌到胞外培养基中... 大肠杆菌是表达重组蛋白最常用的宿主菌之一,但是由于它大多将重组蛋白分泌到菌体内部,导致重组蛋白不能正确折叠或者被降解而失去活性,使得目的蛋白的提取和纯化过程较为繁琐。解决这些问题的方法之一就是将重组蛋白分泌到胞外培养基中,这样不仅有利于蛋白的正确折叠,也会极大地简化目的蛋白的提取和纯化过程。近年发现的YebF蛋白是由大肠杆菌分泌到胞外培养基中的可溶内源性短肽,大小为10.8kDa;虽然其功能未知,但是YebF可作为载体蛋白与重组蛋白融合从而引导异源蛋白的胞外分泌表达。综述了YebF蛋白的结构及其胞外分泌表达的机理,总结了应用YebF分泌途径成功胞外表达异源蛋白的例子,阐述了利用YebF胞外分泌途径提高目的蛋白表达量的策略,为更多重组蛋白的高效分泌表达提供了理论基础。 展开更多
关键词 YebF蛋白 载体蛋白 重组蛋白 外分泌表达 高效分泌策略
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嗜虫耶尔森氏菌HlyA及HasA外分泌表达系统的构建 被引量:1
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作者 黄晨燕 郑茹萍 +5 位作者 黎钟秀 余云钦 罗雨琦 周建双 张飞萍 吴松青 《微生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第8期1612-1623,共12页
[目的]构建一株具备外分泌蛋白功能的工程菌,解决杀虫毒素无法由胞内分泌至胞外,无法直接作用于虫体等问题,为松墨天牛防治提供新思路。[方法]本研究先测定从松墨天牛肠道及其生境中分离出的嗜虫耶尔森氏菌(CSLH88)的生长特性及抗性,进... [目的]构建一株具备外分泌蛋白功能的工程菌,解决杀虫毒素无法由胞内分泌至胞外,无法直接作用于虫体等问题,为松墨天牛防治提供新思路。[方法]本研究先测定从松墨天牛肠道及其生境中分离出的嗜虫耶尔森氏菌(CSLH88)的生长特性及抗性,进而对其进行分子改造。构建HlyA(pGHKW2)以及HasA(pGHKW4)外分泌表达载体,利用电穿孔法将其转入CSLH88菌株,获得能够表达绿色荧光蛋白的工程菌。利用稀释涂板及荧光体式镜检测技术对两个质粒进行遗传稳定性检测,并采用SDS-PAGE及Western blotting技术验证蛋白外分泌功能。[结果] CSLH88菌株培养2-4 h能够进入对数生长期,并对卡那霉素(Kan)敏感。成功构建了含有Kan抗性基因的pGHKW2(GenBank:MK562405)和pGHKW4(GenBank:MK562404)两个外分泌表达载体的CSLH88工程菌株。其中,发现pGHKW4质粒更加适合在嗜虫耶尔森氏菌中稳定遗传。SDS-PAGE及Western blotting检测结果表明HlyA系统无法在CSLH88菌株中将目的蛋白分泌到胞外,而HasA系统则可以有效地发挥外分泌表达功能。[结论]通过对HlyA及HasA两个外分泌表达系统进行研究,从中筛选出HasA型血红素转运系统作为CSLH88菌株的外分泌表达系统,为后续外分泌杀虫毒素蛋白菌株构建以及CSLH88菌株的致病性研究奠定基础。 展开更多
关键词 松墨天牛 嗜虫耶尔森氏菌 外分泌表达系统 绿色荧光蛋白
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雷珠单抗的大肠埃希菌胞外分泌表达、纯化及结构表征
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作者 罗曼玉 高阳 +1 位作者 朱建伟 路慧丽 《中国医药工业杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第2期211-219,共9页
抗血管内皮细胞生长因子(VEGF)抗体可抑制新生血管的形成和生长,在年龄相关性黄斑变性眼科疾病的临床治疗中具有重要应用价值,特别是已上市的商品名为雷珠单抗的VEGF抗体Fab片段,在市场上取得巨大成功。本研究探索了雷珠单抗在大肠埃希... 抗血管内皮细胞生长因子(VEGF)抗体可抑制新生血管的形成和生长,在年龄相关性黄斑变性眼科疾病的临床治疗中具有重要应用价值,特别是已上市的商品名为雷珠单抗的VEGF抗体Fab片段,在市场上取得巨大成功。本研究探索了雷珠单抗在大肠埃希菌中的胞外分泌表达技术,所表达的产品利用SDS-PAGE、Western Blot、肽谱图全序列分析和纳米差示扫描量热法(Nano DSC)等手段进行了初步的结构表征。结果显示,本研究成功实现了雷珠单抗的大肠埃希菌胞外分泌表达,经过进一步的Capto L亲和色谱获得了有正确氨基酸序列的Fab产品,经质谱分析具有正确的二硫键配对,且具有与标准品相似的热稳定性,为其进一步的工业生产奠定了基础。 展开更多
关键词 雷珠单抗 大肠埃希菌 外分泌表达 差示扫描量热法 肽谱图
原文传递
利用α-溶血素系统分泌表达重组人白介素-6 被引量:3
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作者 宁亚蕾 周立雄 +4 位作者 张卫军 鲁东水 肖斌 毛旭虎 邹全明 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期380-384,共5页
目的构建基于大肠杆菌α-溶血素(HlyA)分泌机制的原核胞外分泌表达载体系统,将重组人白介素6(rhIL-6)分泌至胞外培养基中。方法利用分子克隆手段,从引起人泌尿道感染的大肠杆菌UPECJ96菌株染色体上获得了α-溶血素(HlyA)系统的分泌功能... 目的构建基于大肠杆菌α-溶血素(HlyA)分泌机制的原核胞外分泌表达载体系统,将重组人白介素6(rhIL-6)分泌至胞外培养基中。方法利用分子克隆手段,从引起人泌尿道感染的大肠杆菌UPECJ96菌株染色体上获得了α-溶血素(HlyA)系统的分泌功能基因,与外源基因片段hIL-6一起克隆至pQE30骨架载体,构建了胞外分泌表达质粒pISQ,转化E.coliTop10,诱导表达后通过Western blot检测培养上清中hIL-6的表达。结果获得了与设计完全一致的pISU载体,Western blot结果显示,可以在pISQ/E.coli Top10培养液上清中检测到与His-hIL6-HlyAs融合蛋白相对分子质量大小一致的特异条带。结论大肠杆菌HlyA分泌系统操纵子能够在染色体和质粒间传递,rhIL-6能够通过该系统被特异地分泌至胞外培养基中,以可溶形式存在,为后续生物学研究奠定了基础。 展开更多
关键词 人白介素6 α-溶血素分泌系统 hly操纵子 外分泌表达
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海南捕鸟蛛毒素-Ⅳ在大肠杆菌中的分泌表达及纯化
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作者 刘长军 王健杰 +4 位作者 易可 张哲扬 李慧敏 严青 孟尔 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期1191-1199,共9页
海南捕鸟蛛毒素-Ⅳ(hainantoxin-Ⅳ,HNTX-Ⅳ)是从海南捕鸟蛛(Selenocosmia hainana)的毒液中分离得到的一种可以特异性抑制河豚毒素敏感型(TTX-S)钠通道的多肽毒素,并且能够选择性抑制Nav1.7亚型电压门控钠离子通道。HNTX-Ⅳ的成熟肽含... 海南捕鸟蛛毒素-Ⅳ(hainantoxin-Ⅳ,HNTX-Ⅳ)是从海南捕鸟蛛(Selenocosmia hainana)的毒液中分离得到的一种可以特异性抑制河豚毒素敏感型(TTX-S)钠通道的多肽毒素,并且能够选择性抑制Nav1.7亚型电压门控钠离子通道。HNTX-Ⅳ的成熟肽含有35个氨基酸残基,其结构通过3对二硫键稳定。HNTX-Ⅳ是研究钠通道结构和功能以及镇痛药物开发过程中非常有用的一种分子探针,但是其在天然毒素中的含量较少,很难分离足够量的组分进行后续研究。在本研究中,我们通过OEPR克隆构建了HNTX-Ⅳ的大肠杆菌分泌表达质粒pSE-G1M5-SUMO-HNTX-Ⅳ。将质粒pSE-G1M5-SUMO-HNTX-Ⅳ转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行自动诱导分泌表达,含有6×His标签和SUMO标签的融合蛋白质6×His-SUMO-HNTX-Ⅳ成功分泌到大肠杆菌的细胞外培养基中。通过弱阳离子交换柱富集和Ni-NTA柱纯化之后,成功获得了纯度较高的融合蛋白质6×His-SUMO-HNTX-Ⅳ。通过Ulp1激酶切割,重组HNTX-Ⅳ(rHNTX-Ⅳ)被释放出来,并通过RP-HPLC分离获得。通过MALDI-TOF质谱鉴定rHNTX-Ⅳ分子量为3.9876kD。通过膜片钳技术,10μmol/L的rHNTX-Ⅳ能够抑制90%以上的hNav1.7的电流,其IC_(50)值为126 nmol/L。本研究成功将HNTX-Ⅳ分泌到了大肠杆菌的细胞外培养液中,并最终获得了纯度较高且具有生理活性的rHNTX-Ⅳ分子,丰富了HNTX-Ⅳ的制备方法,为其后续研究奠定了基础。 展开更多
关键词 海南捕鸟蛛毒素-Ⅳ 细胞外分泌表达 大肠杆菌
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转β-甘露聚糖酶基因大肠杆菌在猪肠道内的外泌型表达 被引量:1
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作者 王和平 王龙 +2 位作者 文静 高宏斌 范文斌 《内蒙古大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期58-64,共7页
从里氏木霉R u t C-30提取总RNA,用RT-PCR方法克隆到β-甘露聚糖酶成熟肽cD-NA,并将其E coRΙ和B amH I酶切后连接到克隆载体pGEM进行测序,结果与G enB ank公布的完全一致,随后将含有β-甘露聚糖酶基因的重组质粒pGEM-M anΙ经E coRΙ... 从里氏木霉R u t C-30提取总RNA,用RT-PCR方法克隆到β-甘露聚糖酶成熟肽cD-NA,并将其E coRΙ和B amH I酶切后连接到克隆载体pGEM进行测序,结果与G enB ank公布的完全一致,随后将含有β-甘露聚糖酶基因的重组质粒pGEM-M anΙ经E coRΙ、绿豆芽核酸酶、H indⅢ酶切处理和纯化后,与含有Ω序列和T 7启动子以及信号肽Om pT序列的分泌型表达载体pTOO 2连接,构建成表达载体pTOO 2-M an.Ι然后利用大肠杆菌素释放基因(k il)能有效的增加细菌外膜通透性促进周质蛋白外泌的原理,再将表达载体pTOO 2-M anΙ和质粒pUC 18-k il共转化到大肠杆菌BL 21株中,构建成外泌型表达体系BL 21-pTOO 2-M anΙ/pUC 18-k il进行外泌型表达.表达产物经酶活鉴定具有明显的β-甘露聚糖酶活性,经EL ISA双抗夹心法检测,无论在体外或猪肠道内容物内均为阳性,从而实现了该基因的外泌型表达;表达产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,分子量为50.98 kD和53.98 kD,该工程菌通过瘘管灌注到猪肠道内进行表达研究,结果基本令人满意.从而实现了该转基因大肠杆菌在猪肠道中外泌型表达的目的. 展开更多
关键词 外分泌表达 Β-甘露聚糖酶 RT-PCR
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Overexpression of a Foreign Bt Gene in Cotton Affects the Low-Molecular-Weight Components in Root Exudates 被引量:6
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作者 YAN Wei-Dong SHI Wei-Ming LI Bao-Hai ZHANG Min 《Pedosphere》 SCIE CAS CSCD 2007年第3期324-330,共7页
Most research in the past using genetically modified crops (GM crops) has focused on the ecological safety of foreign gene (i.e., the gene flow), gene products (for example, Bt (Bacillus thuringiensis) protein), and t... Most research in the past using genetically modified crops (GM crops) has focused on the ecological safety of foreign gene (i.e., the gene flow), gene products (for example, Bt (Bacillus thuringiensis) protein), and the safety of transgenic food for humans. In this study, changes in both the species and amounts of low-molecular-weight components in cotton (Gossypium hirsutum L.) root exudates after foreign Bt gene overexpression were investigated under different nutritional conditions. Transgenic cotton containing Bt (Bt-cotton), supplemented with all the mineral nutrients, secreted more organic acids than the wild-type cotton (WT). When nitrogen was removed from the full-nutrient solution, the amount of organic acids secretion of Bt-cotton was lesser than that of WT. The roots of the transgenic cotton secreted lesser amounts of amino acids and soluble sugars than the WT roots in the full-nutrient solution. Deficiencies of P and K caused a large increase in the total amino acid and soluble sugar secretions of both Bt-cotton and WT, with larger increases observed in Bt-cotton. Because transferring the foreign Bt gene into cotton can result in alterations in the components of the root exudates, with the effect varying depending on the nutritional status, the cultivation of genetically modified crops, such as Bt-cotton, in soil environments should be more carefully assessed, and the possible effects as a result of the alterations in the root exudate components should be considered. 展开更多
关键词 gene overexpression low-molecular-weight components nutritional status root exudates transgenic cotton
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