疏绵状嗜热丝孢菌外切β-葡聚糖酶的基因克隆与酶学特征

【目的】疏绵状嗜热丝孢菌是一种嗜热丝状真菌,具有合成与分泌多种耐热酶的能力,从中找寻酶活高、耐热性能优良的β-葡聚糖酶。【方法】对疏绵状嗜热丝孢菌其中一个外切β-葡聚糖酶的编码基因gln B进行克隆,并在毕赤酵母GS115中表达。【结果】在摇瓶水平上重组菌的产酶活为11.5 U/m L,重组酶在SDS-PAGE中的大小约为48 k D。重组Gln B最适作用温度为65°C,最适作用p H为5.0;在低于50°C或p H 3.0-10.0之间具有良好稳定性。重组酶水解海带三糖,首先生成单糖和二糖,延长酶作用时间,可以进一步将其中的二糖部分水解为单糖。【结论】疏绵状嗜热丝孢菌来源的重组酶Gln B为外切β-葡聚糖酶,具有较好的耐热性能和p H稳定性。

一种灰盖鬼伞外切β-1,3葡聚糖酶基因的克隆与表达

为了简单快速地获取大量的β-1,3葡聚糖酶以研究其在真菌形态发生过程中所发挥的作用,本研究以灰盖鬼伞的c DNA为模板克隆了一种编码外切β-1,3葡聚糖酶的基因,并将该基因插入表达质粒p ET28A(+)中,获得了重组表达质粒p ET28A(+)-exg,转化到E.coli Rosetta菌株中并进行异源重组表达.结果显示,克隆基因的c DNA全长2 415 bp,共编码786个氨基酸;SDS-PAGE电泳表明该基因在E.coli Rosetta菌株中得到了高效表达,重组表达的酶蛋白表观分子量为85 k Da;纯化后获得的表达酶经DNS法测得比活力为45 U/mg.酶学性质测定结果表明,该酶具有β-1,3葡聚糖外切酶活性,以昆布多糖为底物时,最适反应条件为p H 6.0、温度60℃,且有一定的耐热能力和较好的p H稳定性,具有较好的应用前景.

外切-β-葡聚糖酶基因重组里氏木霉的筛选及其产酶性能

外切-β-葡聚糖酶是纤维素酶的重要组分之一,提高该组分的活力是增强纤维素酶协同降解性能、降低纤维素水解成本的关键。分别采用微晶纤维素琼脂平板法和滤纸崩解法,对已有的基因重组转化子进行筛选试验,获得了6个优良转化子,其滤纸崩解速率和微晶纤维素琼脂平板上的生长速率都较大。进一步在摇瓶条件下进行复筛试验,获得了外切-β-葡聚糖酶(C1)高产转化子Trichoderma reesei ZU-101,液体培养48 h,其C1酶活力可达18.24 U·ml-1,是出发菌株的2.16倍;分析结果表明:重组转化子的纤维素酶体系中内切-β-葡聚糖酶和纤维二糖酶的活力与出发菌株相比变化不大,但由于外切-β-葡聚糖酶活力得到了大幅度提高,纤维素酶的总活力(滤纸酶活力FPA)也提高了61.9%。采用纤维素酶对碱预处理玉米秸秆进行酶解试验,当酶用量为20 FPIU·(g底物)-1,水解48 h,重组转化子T.reesei ZU-101纤维素酶的酶解得率高达94.4%。本文的研究结果在可再生纤维素资源的生物转化与利用方面具有广阔的应用前景。

福寿螺多功能纤维素酶(EGXA)的结构功能研究

利用点突变的方法构建了E332A、E332S和D290Q的多功能纤维素酶EGXA）的突变体，研究了在甲醇酵母中重组表达的突变体的酶学性质。结果表明：E332可能是该酶的活性必需基团，而D290Q突变体的外切葡聚糖酶及内切木聚糖酶活性均提高2～3倍，对EGXA研究及其应用提供了理论依据。

家蝇纤维素酶的检测及酶活性与其发育的关系

为了解家蝇能否降解利用纤维素,采用DNSA法检测家蝇幼虫纤维素酶活性及酶学特性;并进一步研究纤维素酶活性与家蝇发育的关系.结果显示,在生长发育的不同时期,家蝇都具有滤纸酶活性,活性范围为0.85(±0.035)IU mg-1至10.45(±0.050)IU mg-1;家蝇纤维素酶的组成包含3种酶,即β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,BG)、内切β-1,4-葡聚糖酶(Endo-β-1,4 glucanase,EG)和外切β-1,4-葡聚糖酶(Exo-β-1,4-glucanase,CBH).在pH 5.6的条件下,这3种酶的最适反应温度和时间分别为50℃和60 min,在体外具有较强的热稳定性,50℃放置1 h后仍可保持较强的酶活性.纤维素酶活性随着家蝇的发育逐渐增高(P<0.05),卵的酶活性最低,成虫的酶活性最高,在最适反应条件下,成虫BG、EG和CBH的活性分别为(7.96±0.065)IU mg-1、(9.76±0.080)IU mg-1和(10.86±0.091)IU mg-1.这3种酶的活性在家蝇卵、幼虫、蛹和成虫4个发育阶段,均是CBH最高,BG最低.增加家蝇幼虫饲料中粗纤维的含量,3龄幼虫的纤维素酶活性明显提高(P<0.05),而平均体重和体长与对照组比无显著差异(P>0.05).研究表明家蝇具有完整的降解利用植物纤维素的酶系,其纤维素酶活水平与家蝇的发育密切相关.