核酸外切体成分4在初治弥漫大B细胞淋巴瘤患者中的表达及临床意义

目的:探讨初治弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者组织中核酸外切体成分4(EXOSC4)的表达情况及其临床意义。方法:采用免疫组织化学染色方法检测181例初治DLBCL患者组织中EXOSC4蛋白的表达情况;收集临床资料,并分析初治DLBCL患者组织中EXOSC4蛋白表达与临床特征的相关性及其预后意义。结果:181例初治DLBCL患者组织中,EXOSC4蛋白表达阳性率为68.51%;将患者分为高表达组44例和低表达组137例,两组患者年龄、性别、B症状、血清乳酸脱氢酶(LDH)水平、美国东部肿瘤协作组(ECOG)评分、Ann Arbor分期、结外侵犯、国际预后指数(IPI)评分、国家综合癌症网络IPI(NCCN-IPI)评分、细胞起源等特征的差异均无统计学意义(P>0.05)。Cox多因素回归分析结果显示,组织EXOSC4蛋白高表达是初治DLBCL患者OS和PFS的独立不良预后因素(均P<0.05)。K-M生存分析结果显示,组织中EXOSC4蛋白高表达初治DLBCL患者总生存期和无进展生存期较低表达患者显著缩短(均P<0.05)。结论:初治DLBCL患者组织EXOSC4蛋白高表达是影响生存的独立不良预后因素。

外切体复合物基因3在肝癌中的预后价值及其免疫相关性

目的:基于生物信息学和实时定量PCR(qRT-PCR)实验分析外切体复合物基因3(EXOSC3)在肝癌中的差异表达、预后价值、潜在机制及其免疫相关性。方法:运用TCGA数据库和ICGC数据库分析EXOSC3在肝癌中的表达情况和预后价值,并用qRT-PCR验证EXOSC3在肝癌中的表达。在TCGA数据库中分析EXOSC3在肝癌中的共表达基因并进行GO和KEGG富集分析。运用TIMER数据库和CIBERSORT算法分析EXOSC3与肿瘤免疫细胞浸润的相关性,评估其对免疫检查点抑制治疗的疗效。结果:EXOSC3在肝癌中高表达并与患者预后显著相关,共表达基因富集分析显示EXOSC3可能通过细胞周期、p53等信号通路调控肝癌的发展进程。同时,EXOSC3与6种免疫细胞浸润显著相关,并可能影响免疫抑制治疗疗效。结论:EXOSC3可作为一种影响肝癌的预后标志物,其可能通过影响细胞周期、p53等信号通路及免疫细胞免疫应答过程控制肝癌的发展进程。

肿瘤源性外切体负载的间充质干细胞抗肿瘤活性的实验研究

目的:分离并纯化BALB/c小鼠肝癌恶性腹水来源的外切体及同基因小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs);将外切体负载经γ干扰素(IFN-γ)刺激活化的间充质干细胞,探讨其抗肝癌细胞活性改变。方法:利用超滤及密度梯度离心法分离并纯化BALB/c小鼠肝癌恶性腹水来源的外切体;利用贴壁培养联合免疫磁珠阴性分选法体外培养同基因小鼠骨髓间充质干细胞;外切体负载活化的间充质干细胞与小鼠肝癌H22细胞共孵育,72h后观察H22细胞增殖状态。结果:外切体负载的IFN-γ刺激活化的间充质干细胞与小鼠肝癌H22细胞共孵育72h后,活化组H22细胞增殖速度明显低于对照组。结论:负载肿瘤源性外切体的间充质干细胞抗肝癌细胞活性明显增强,间充质干细胞联合肿瘤源性外切体有可能成为一种更为有效的外切体疫苗诱导抗肿瘤效应。

离心过滤法提取外切体的实验研究

目的 :利用外切体的物理特性 ,用基于孔径分离的生物膜离心过滤法制备外切体 ,以降低其研究及应用的技术门槛 .方法 :以树突状细胞的培养上清作为外切体的来源 ,分别用传统的超高速密度梯度离心法和生物膜离心过滤法制备外切体 ,再利用透射电镜进行两者之间形态学鉴定 ,聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质成分的鉴定 .结果 :两种方法的提取物在超微结构及形态方面非常相像 ,其蛋白质谱几乎一致 .结论 :基于生物膜分离技术的离心过滤法可制备出外切体 .

脐带间质干细胞来源的外切体对顺铂诱导的人肾小管上皮细胞损伤的修复作用

目的:研究人脐带间质干细胞来源的外切体(hucMSC-Ex)对顺铂诱导的人肾小管上皮HK-2细胞损伤的修复作用,并探讨可能的作用机制。方法:体外建立顺铂诱导的HK-2细胞损伤模型,实验组以16μmol/L浓度的顺铂作用HK-2细胞16 h,再加入hucMSC-Ex共培养,同时选择人肺成纤维细胞的外切体(HFL1-Ex)为对照,8 h后采用蛋白质印迹法和FITC-Tunel技术检测hucMSC-Ex对损伤HK-2细胞的抗凋亡和促增殖情况。未经任何处理的HK-2细胞作为正常对照组,单纯顺铂损伤并加等量PBS为PBS对照组。结果:成功建立了顺铂诱导的HK-2细胞损伤体外模型,蛋白质印迹分析显示hucMSC-Ex处理改善了顺铂对HK-2细胞的损伤,凋亡蛋白Bax表达降低,抗凋亡蛋白Bcl-2表达相应升高。FITC-Tunel检测也显示HK-2细胞的凋亡明显减弱。而MTT分析显示hucMSC-Ex处理后,HK-2细胞的增殖能力显著增强。结论:HucMSC-Ex对顺铂诱导的HK-2细胞损伤有一定的修复效果,可能是通过促进HK-2细胞的增殖和抑制其凋亡来实现的。

大鼠骨髓间质干细胞来源的外切体抑制顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡

目的:观察大鼠骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)来源的外切体(exosome)对顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡的影响。方法:原代培养大鼠骨髓MSC并提取外切体鉴定。构建顺铂损伤NRK-52E细胞模型,损伤组为5μmol/L顺铂处理6 h后正常营养液培养48 h,处理组为顺铂损伤后以100μg/m L外切体共培养48 h。未经任何处理的NRK-52E细胞为对照组。TUNEL-FITC,凋亡双染流式细胞术,蛋白质免疫印迹技术检测各组细胞凋亡情况。结果:与对照组比较,损伤组NRK-52E细胞肿大,胞核不规则样改变,凋亡细胞增多,凋亡相关蛋白Bax上调而Bcl-2下调;处理组NRK-52E细胞肿大较损伤组缓解,胞核形态改善,凋亡细胞减少,Bax下调且Bcl-2上调。结论:大鼠骨髓MSC来源的外切体对顺铂诱导的NRK-52E细胞凋亡有一定的抑制作用。

真核生物核酸外切体(exosome)的研究进展

RNA的加工和降解是调控基因时空表达的重要步骤,在调节生物体的生长和发育过程中起着至关重要的作用.几乎所有的RNA都是从一条长的前体加工处理而来,形成成熟的RNA发挥功能,之后进行降解.RNA的降解需要5′-3′核酸外切酶、3′-5′核酸外切酶及核酸内切酶的参与.在真核细胞中,部分3′-5′核酸外切酶所进行的RNA降解依赖于一种称为核酸外切体(exosome)的复合物.该复合物由9个核心蛋白亚基组成,已有的证据表明,其广泛参与了动物、酵母及植物体中多种RNA的加工和降解过程.本文综述了真核生物中核酸外切体的研究进展,讨论了该复合体在RNA加工降解过程中的作用机制.

干细胞外切体对大鼠心肌缺血再灌注损伤及Akt/GSK-3β通路的影响

目的探讨骨髓源性心肌干细胞来源的外切体对大鼠心肌缺血再灌注损伤及Akt/GSK-3β通路的影响。方法64只SD大鼠随机分为假手术组(S组)、缺血再灌注组(I/R组)、外切体干预组(Ex组)、外切体干预联合PI3K抑制剂组(Ex+L组)。再灌注后2 h各组取8只大鼠,ELISA法测定血清乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平,Western blot测定检测心肌组织Akt和P-GSK-3β水平;其余8只大鼠存活4周后用Masson染色检测心肌组织中胶原纤维。结果与I/R组相比,Ex组血清CK-MB、LDH水平降低,心肌胶原纤维减少,心肌Akt和P-GSK-3β水平增加(均P<0.01)。结论骨髓源性心肌干细胞来源的外切体可减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤,这种保护作用可能与Akt/GSK-3β信号通路激活有关。

羊水中外切体的鉴定与其RNA浓度测定

【目的】分离鉴定羊水中的外切体,并测定羊水外切体中RNA的浓度,探讨从羊水外切体中提取RNA的可行性,从而进一步为胎儿肾脏疾病产前诊断和胎儿肾功能监测寻找生物指标提供研究基础。【方法】对8例妊娠22～30周并有产前诊断指征的孕妇分别采用常规羊膜腔穿刺术收集到羊水10 mL进行检测分析,通过多步离心法及蔗糖密度梯度离心法提取羊水中的外切体,采用透射电镜、流式细胞术及激光共聚焦对其进行鉴定,trizol法对分离到的外切体进行RNA提取,紫外分光光度计测定其RNA浓度。【结果】透射电镜结果示微囊小体形态均一、大小相近,直径范围40～100 nm,呈外切体典型的杯状结构,由脂质双层膜包裹的扁平球体,其外周及内含物均可见负染效应;流式细胞仪上可见CD24阳性率为(92.23±3.8)%;共聚焦显微镜下进行检测,于胶珠表面可见到荧光带;紫外分光光度计测得的RNA浓度分别为28.67、30.02、37.57、21.08、49.41、24.57、24.24、26.77 ng/μL,平均浓度为30.29 ng/μL。【结论】羊水中含有外切体,且其表面CD24分子阳性,说明其来源于胎儿肾脏。羊水中外切体含有RNA,由羊水中分离外切体并提取RNA可为进一步对胎儿肾脏疾病的产前诊断和胎儿肾功能的监测寻找生物指标提供基础材料。

外切体研究进展

外切体是酿酒酵母中鉴定的一个保守复合体 ,具有 3′外切核酸酶的活性 .10个核心亚基 ,除Csl4p/Ski4p外 ,在体外都具有 3′外切核酸酶的活性 .外切体在多种RNA的代谢中起重要作用 .外切体普遍存在于真核生物中 ,并与真核基因的表达调控密切相关 .

人脐带间质干细胞来源的外切体对大鼠心肌细胞缺血/再灌注损伤的作用

目的:研究人脐带间质干细胞来源的外切体(hucMSC-exosome)对大鼠缺血/再灌注(I/R)损伤心肌细胞的修复作用。方法:在体内,建立大鼠I/R模型:经冠状动脉左前降支(LAD)结扎缺血30 min后取消结扎恢复灌注,与此同时,尾静脉注射hucMSC-exosome。在体外,建立大鼠H9C2(2-1)心肌细胞缺氧/复氧(H/R)模型:细胞于无血清低糖培养基中缺氧(5%CO2/93%N2)24 h后,用含hucMSC-exosome的高糖10%FBS培养液复氧24 h。采用MTT法、TUNEL法、心肌酶谱以及线粒体膜电位等方法检测大鼠心肌细胞的增殖和凋亡状况。结果:在体内,心肌细胞经I/R损伤后,hucMSC-exosome与hucMSC处理组较PBS处理组血清乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)值均下降;TUNEL结果显示,前两组较PBS处理组心肌细胞凋亡明显减少;在体外,心肌细胞经H/R损伤后,MTT实验表明细胞增殖显著减弱,hucMSC-exosome作用后,TUNEL及线粒体膜电位(ΔΨm)结果分别显示受损心肌细胞凋亡以及膜电位下降明显减少。结论:hucMSC-exosome能有效抵抗心肌细胞因缺血/再灌注损伤而引起的细胞凋亡。

人脐带间质干细胞来源的外切体对大鼠肾小管上皮细胞缺氧损伤的干预作用

目的:观察体外缺氧损伤的大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)凋亡情况以及分离纯化人脐带间质干细胞来源的外切体(hucMSCs-exosomes)对其干预作用。方法:将体外培养的NRK-52E细胞随机分为对照组、缺氧损伤模型组和hucMSCs-exosomes(0.5,1.0 mg/ml)预处理组。随后进行细胞计数,蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白(Bcl-2,bax)的表达变化,流式细胞仪检测细胞周期以及凋亡率的变化。结果:与对照组相比,模型组细胞凋亡相关指标均明显升高,细胞计数下降(P<0.01),Bcl-2/bax表达下调(P<0.01),细胞周期S期阻滞以及凋亡细胞比例明显增多。而hucMSCs-exosomes预处理组可明显改善缺氧损伤时的细胞活力,上调Bcl-2/bax的表达,改善细胞周期和凋亡细胞的比例(P均<0.05)。结论:NRK-52E在缺氧损伤时有明显的细胞凋亡,而hucMSCs-exosomes预处理可能通过抗凋亡途径减轻缺氧时细胞的损伤。本实验可为进一步研究hucMSCs-exosomes在组织损伤修复中的生物学功能和相关机制提供实验基础。

体外肝切除技术的进展

近年来随着手术器械的更新和围手术期处理的完善,肝脏切除术安全性不断提高.但某些特殊部位的肝肿瘤,当肿瘤侵犯下腔静脉、肝腔静脉汇合部,肝内主要血管,由于常规肝切除受到肝热缺血时间限制而多不能采用手术治疗.

MCSCs-exosomes对成年大鼠心肌细胞缺氧损伤的干预作用

目的探讨来源于骨髓源性心肌干细胞的外切体(MCSCs-exosomes)对成年大鼠心肌细胞体外缺氧损伤诱导凋亡的干预作用。方法将体外培养的成年大鼠心肌细胞随机分为对照组、缺氧组和MCSCs-exosomes预处理组。随后进行形态学观察、细胞计数,蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白(Bcl-2,bax)的表达变化,流式细胞仪检测凋亡率的变化。结果与对照组相比,缺氧组细胞凋亡相关指标均明显升高,细胞计数下降(P<0.01),Bcl-2/bax表达下调(P<0.01),凋亡细胞比例明显增多。而MCSCsexosomes预处理组可明显改善缺血缺氧损伤时的细胞活力,上调Bcl-2/bax的表达,降低凋亡细胞的比例(P均<0.05)。结论 MCSCs-exosomes预处理可以明显改善体外培养缺氧损伤诱导的成年大鼠心肌细胞的凋亡情况,其机制可能是通过抗凋亡途径减轻缺氧时细胞的损伤。

间充质干细胞源性微囊泡在关节软骨损伤修复中的应用

微囊泡（microvesicles,MVs）是机体细胞在生理和病理状态下释放的直径在30-1 000nm之间的微小囊泡[1]。1967年,Wolf在血液系统中发现并首次报道了MVs,当时仅被看作细胞活化或损伤的标志物。近年来,随着研究的深入,MVs的损伤修复功能逐渐引起了人们的重视。

转染pcDNA-FLAG-EXOSC2质粒对宫颈癌HeLa细胞增殖与凋亡的影响

目的观察转染pcDNA-FLAG-EXOSC2质粒对宫颈癌He La细胞增殖与凋亡的影响。方法构建pcDNA-FLAG-EXOSC2重组质粒。将体外培养的He La细胞分为EXOSC2过表达组、空质粒组,分别转染pcDNA-FLAGEXOSC2重组质粒、pcDNA3.1(+)质粒。采用CCK-8法观察各组细胞增殖情况(结果以OD450表示),采用流式细胞术检测各组细胞凋亡率。结果 EXOSC2过表达组、空质粒组OD450分别为0.665 2±0.050 94、0.443 6±0.035 19,两组OD450相比,P<0.05。EXOSC2过表达组、空质粒组细胞凋亡率分别为5.99%±0.37%、7.57%±0.64%,两组细胞凋亡率相比,P<0.05。结论转染pcDNA-FLAG-EXOSC2可以促进宫颈癌He La细胞增殖并抑制其凋亡。

RNA酶Rrp44的结构和功能

Rrp44是一种保守的RNA酶,是外切酶复合体的催化亚基,催化细胞核和细胞质RNA 3’至5’降解。Rrp44在RNA质量控制、基因的转录后调控、小RNA的形成等方面有着重要作用。目前,许多关于Rrp44在机体水平上功能的研究表明,Rrp44在细胞周期进程和微管组装中具有重要作用;同时,Rrp44也与哺乳动物B细胞抗体多样化有关。现回顾Rrp44的结构和功能,以加深对Rrp44的认识。

八肋游仆虫中无义介导的mRNA降解途径因子的细胞共定位研究

无义介导的mRNA降解途径(nonsense-mediated mRNA decay, NMD)是一种mRNA质量监控机制,识别和降解含有提前终止密码子(premature termination codons, PTCs)的异常转录本,以保障基因的准确表达。到目前为止,有报道的从高等哺乳动物到果蝇、线虫、酵母和原生动物中,均有NMD调控途径,但其机制模型存在一定的差异。由于原生动物在生物的起源与进化上的特殊地位,以及所含的调控因子相对简单,在各种分子机制的研究领域成为热点材料。本文以八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)作为研究对象,从八肋游仆虫大核基因组数据库中,经过同源序列比对,分析鉴定到参与NMD途径的相关因子,包括无义mRNA识别因子poly(A)结合蛋白(poly(A) binding protein, PABP);启动NMD途径的核心因子上游移码蛋白1(up-frameshift 1, UPF1)和上游移码蛋白2(up-frameshift 2, UPF2);外显子连接复合体(exon junction complex, EJC)组分因子MAGO(Mago nashi)、Y14(Tsunagi或RMB8)、eIF4AIII(eukaryotic initiation factor 4A3)和UAP56(U2AF56 associated protein 56);降解无义mRNA的相关因子外切体(exosome)、脱帽酶(decapping mRNA 2, DCP2)、外切酶(5′-3′exoribonuclease 1, XRN1)和去腺苷酸化酶(PGK promoter directed over production, POP2)。其中,后3种蛋白质是mRNA加工小体(processing body, P-Body)的组分。通过荧光共定位分析,分别依次证实UPF1与UPF2之间、EJC组分因子之间和P-body组分因子之间的相互作用关系。随后,通过UPF2分别与MAGO和Y14的荧光共定位结果,推测八肋游仆虫依赖于EJC的NMD途径模型。通过UPF1分别与DCP2和外切体(exosome)的荧光共定位结果,推测了八肋游仆虫无义mRNA的两种降解方式:一种是无义mRNA被介导到P-body中分别被DCP2和POP2脱去5′端帽和3′端Poly(A)尾,随后在XRN1的作用下,沿着5′→3′的方向降解;另一种是在胞质中,无义mRNA直接通过招募POP2去腺苷酸化,随后又在招募来的外切体作用下,沿着3′→5′的方向降解。

核酸外切酶Ⅷ截短体的重组表达及其在体外DNA重组反应中的应用

核酸外切酶Ⅷ(ExonucleaseⅧ,ExoⅧ)是一种不依赖于ATP的dsDNA 5?-3?核酸外切酶,可作为体外DNA重组反应极具应用价值的候选蛋白。目前关于ExoⅧ在体外DNA重组反应中的应用尚未有文献报道。本研究构建了保留完整外切活性的截短ExoⅧ(Truncated exonucleaseⅧ,tExoⅧ)的重组表达载体pET28a-tExoⅧ,实现了tExoⅧ在大肠杆菌中的高效表达,在纯化获得高纯度蛋白的基础上,对体外重组反应的温度、反应时间、同源臂长度等因素进行了优化分析。研究结果表明,tExoⅧ在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达,每升可纯化92.40 mg tExoⅧ,比活力为1.21×10~5 U/mg;在10μL的重组体系中,2.5 U的tExoⅧ于25℃反应12.5min随后50℃保温50 min时重组效率最高。添加Pfu DNA聚合酶的体外同源臂延伸策略可以有效提高重组克隆的效率。以转化效率为2.2×10~6 CFU/μg的Mach1T1为受体细胞,对于含有21 bp同源臂的1 kb片段与5.8 kb线性化载体的重组,每微克载体可形成1.1×10~4个重组克隆,且阳性率大于80%。同源臂长度在8–21bp范围内,重组反应效率随着同源臂长度增加而提高。在最佳反应条件下,同源臂长度仅为8bp仍可实现有效的重组反应。ExoⅧ介导的体外重组体系具有酶制备方法简单、对DNA的克隆无酶切位点限制及高重组克隆效率等显著优点,是分子生物学领域具有潜在应用价值的高效基因克隆新体系。