MRP8过表达促进重组酿酒酵母外切纤维素酶生产

增强酿酒酵母纤维素酶分泌能力,为提高利用联合生物加工生产纤维素乙醇的效率提供基础。采用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,在分泌表达外切纤维素酶CBH1的酿酒酵母Y294中过表达线粒体核糖体蛋白基因MRP8。与对照菌株相比,过表达MRP8重组酵母的胞外CBH1酶活提高了约80%。实时定量PCR结果分析表明,在MRP8过表达突变体中,CBH1转录水平高于对照菌株,但是与蛋白折叠和分泌相关的关键基因转录水平没有明显变化。在刚果红平板和含有衣霉素或二硫苏糖醇的平板上生长没有受到影响。胞内ATP含量和活性氧积累未发现显著差别。本研究表明MRP8过表达促进外切纤维素酶的生产。

外切纤维素酶的研究与应用进展

纤维素酶主要包括三大类:外切纤维素酶、内切纤维素酶和β-葡萄糖苷酶。其中,外切纤维素酶因具有活性高、耐受性好、来源广等特点而被广泛应用于各种工业生产中。基于此,主要阐述了外切纤维素酶的分类、来源以及生化特性,介绍了外切纤维素酶的筛选及其水解产物分析的相关新技术,并综述了其在造纸业、食品加工业、制药业、纺织业、能源再生等工业领域中的应用进展,以期推动外切纤维素酶的深入研究及工业化应用。

对硝基苯纤维二糖苷(PNPC)结合于外切纤维素酶Ⅰ(CBHI)时分子构型和构象变化的研究

以固定浓度的外切纤维素酶Ⅰ(1,4-β-D-glucan cellobiohydrolaseⅠ,CBHI),对不同浓度的对硝基苯纤维二糖苷(p-nitrophenol-D-cellobioside,PNPC)在4℃下进行结合.以紫外线光谱、荧光光谱的变化和等温滴定量热法(isothermal titration calorimitry,ITC)分别确定酶的饱和结合位点数(saturation binding point,SBP).然后,对在4℃和SBP条件下,结合时形成的"PNPC-CBHI"复合物进行PNPC分子构型变化和CBHI分子构象变化的分析.结果表明,在水解反应不能进行的条件下,CBHI结合PNPC的反应是一个由负焓变(??H)控制的不可逆的放热过程.结合可导致PNPC的构型转变为PNP(对硝基苯)分子构型,而CBHI的构象变化可循环发生."PNPC-CBHI"复合物与CBHI和PNPC之间不存在可逆性的平衡过程,在酶分子不断循环进行的结合/解离过程中,由CBHI构象变化提供的能量,使PNPC分子不断转化为PNP分子构型,结合复合物解离出PNP与纤维二糖后,再生的CBHI才可与PNPC结合.并对这一结果应用于解释酶催化机理的普适性进行了讨论.

纤维二糖抑制外切纤维素酶水解作用机理的分析

纤维二糖是纤维素分子的结构单元,也是纤维素酶水解纤维素时的主要产物。它能强烈抑制纤维素酶的水解作用,但并不影响酶对纤维素的吸附。红外、荧光、圆二色谱分析表明,纤维二糖可结合在外切纤维素酶活性部位附近的色氨酸残基上形成“位阻效应”,从而阻止纤维素分子链进入活性中心。同时,结合纤维二糖后,外切纤维素酶分子构象发生了较大变化,致使吸附纤维素后不能导致微纤维的分离,为“无效吸附”。

长梗木霉外切纤维素酶CBH Ⅱ基因的克隆及表达

分别以长梗木霉(Trichoderma longibrachiatum)XST1的基因组DNA和cDNA为模板PCR扩增其外切纤维素酶Ⅱ(cellobiohydrolaseⅡ,CBHⅡ)的全长基因cbhⅡ。序列分析表明:cbhⅡ基因全长1583bp,含3个内含子,分别为94～144bp,529～584bp和832～894bp。该基因编码的外切纤维素酶Ⅱ蛋白全长470个氨基酸(其中前24个氨基酸为信号肽)。将全长的cbhⅡ基因连接到pPIC3.5K上,转化毕赤酵母GS115(Pichia pastoris GS115)。重组转化子96h诱导培养,发酵上清液水解pNPC的酶活为18.1U/L。SDS-PAGE检测结果表明:浓缩的重组转化子发酵液较对照菌株的发酵液中,有一明显加强的蛋白质条带,Mr约为67k。

降解水稻秸秆的复合菌系及其微生物群落结构演替

【目的】比较和分析从堆肥中富集的水稻秸秆降解菌系F1和F2的纤维素分解能力、微生物群落结构及其在秸秆降解过程中的演替,从而探究微生物群落结构与秸秆降解效率的相关性。【方法】采用DNS(3,5-二硝基水杨酸,3,5-dinitrosalicylic acid)定糖法测定发酵液中的外切纤维素酶活;采用范氏(Van Soest)洗涤纤维分析法测定发酵前与发酵后的秸秆纤维素、半纤维素、木质素的含量,并计算降解率;采用16S r RNA基因序列分析和实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,Q-PCR)对秸秆降解过程中的微生物物种组成及特定的功能微生物进行定性和定量分析。【结果】复合菌系F1的水稻秸秆总降解率、纤维素降解率、半纤维素降解率显著高于复合菌系F2;2种复合菌系的外切纤维素酶活性与cel48基因的拷贝数变化趋势一致;复合菌系F1的物种较丰富,优势物种是好氧细菌,复合菌系F2的物种组成较单一,培养后期具有较高比例的厌氧纤维素分解菌;培养前4天,复合菌系F1和F2的优势物种均为Unclassified Bacillales和Bacillus;第4天之后,不同复合菌系的优势物种及丰度出现差异,F1的优势物种主要属于Bacteroidetes,F2的优势物种主要属于Firmicutes;虽然Petrimonas和Pusillimonas是培养后期的共有优势物种,但是Petrimonas在复合菌系F2中的相对丰度(38.30%)显著高于F1(9.47%),且培养第8天的F2中的Clostridiales OPB54增加至14.85%。【结论】cel48基因拷贝数变化与秸秆纤维素的降解效率、外切纤维素酶活性变化具有一定的相关性,cel48基因可作为潜在的生物分子标记监测秸秆纤维素的降解过程;微生物群落结构对秸秆纤维素的降解效率具有显著影响,Unclassified Bacillales,Bacillus,Petrimonas,Pusillimonas是复合菌系F1和F2降解秸秆纤维素过程中的重要物种。

持续性催化酶类机理研究及其分子动力学模拟

酶分子催化机理研究是生命科学研究领域一个重要的问题.近80年来,过渡态理论在解释酶催化机理问题上占据了主导地位,结合热力学循环、锁钥学说、诱导契合学说以及酶活性中心柔性学说等理论,可以很好地解释多种酶分子的催化过程.近年来,随着蛋白质结构解析方法、单分子分析检测技术及计算机模拟技术的发展,人们对酶分子催化机理的认识愈加深刻.但持续性催化酶类的催化动力研究表明,过渡态理论的解释并不充分.本文对酶催化机理研究的相关进展进行了综述,并针对持续性酶类催化动态过程的特点提出了可能的研究方向及可行的研究方法.