牙龈卟啉单胞菌ATCC 33277菌株外切聚磷酸酶的表达、纯化和结晶

外切聚磷酸酶(exopolyphosphatase,PPX)对于细菌在恶劣环境下引起的严紧反应、病原菌的致病性和抗生素耐药性等生物学过程必不可少。牙龈卟啉单胞菌是与牙周炎关系最密切的病原菌。为解析牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)ATCC 33277菌株的外切聚磷酸酶(PgPPX)的结构,首先利用大肠杆菌对PgPPX蛋白基因进行克隆与蛋白表达,然后依靠谷胱甘肽巯基转移酶标签对融合蛋白亲和层析后,采用阴离子交换色谱、凝胶过滤色谱得到表面电荷、聚合形态均一的PgPPX蛋白,最后对纯化后的目的蛋白进行结晶条件筛选。结果表明:PgPPX蛋白在溶液中表现为二聚体形式,纯度大于98%,表达量高达30 mg/L,且该蛋白在0.2 mol/L MgSO 4·6 H 2O、20%PEG3350(m/V)条件下获得的晶体形状较好。

霍乱弧菌外切聚磷酸酶PPX的表达、纯化和初步晶体学研究

霍乱弧菌(Vibrio cholera)作为弧菌科的主要致病菌,是人类霍乱的病原体,它可以引起烈性肠道传染病,给人们的生命造成了巨大的威胁.多聚磷酸polyP广泛分布于细菌体内,在细菌的运动性、细胞膜的形成、严紧反应等过程中发挥关键作用,而外切聚磷酸酶PPX是水解polyP的主要蛋白,可直接影响细菌的致病性.本研究利用大肠杆菌原核表达的方法成功获得可溶性霍乱弧菌PPX蛋白,经过多种方式的纯化、结晶条件的筛选和优化得到蛋白晶体.通过X射线衍射实验收集到0.24 nm的衍射数据,使用HKL 2000软件对衍射数据进行了处理,这些数据为PPX晶体结构的解析奠定基础.

多聚磷酸盐在原核和真核生物中的研究进展

多聚磷酸盐(polyphosphate,poly P)广泛存在于自然界无机环境和生命有机体。细菌学研究显示,poly P可增强细胞抵抗外界恶劣环境的能力,促进严瑾反应(strigent response)和孢子形成,促进生物被膜的形成,提高捕食能力,增强细菌毒力等。对真核生物的研究发现,poly P可以促进正常成骨细胞和成纤维细胞分化成熟,参与胞内钙的贮存与释放,刺激一些肿瘤细胞增殖等。本文从现有的信息入手,推测poly P在神经系统中的功能。

多聚磷酸盐及其代谢酶的研究进展

多聚磷酸盐(polyP)是由几个到几百个无机磷酸盐单体通过高能磷酸键聚合而成的线性多聚体,广泛分布于自然界和生物体。本文总结了polyP在生物体中的重要功能,包括基因表达和调控、DNA的摄取、微生物的运动性、对胁迫和饥饿的应答、病原菌的毒性以及对细胞凋亡、血液凝固、细胞钙化、线粒体功能的调节,需要polyP的酶有内切酶、葡萄糖激酶、NAD激酶和AMP磷酸转移酶等。本文对调控polyP的多聚磷酸盐激酶(polyphosphate kinase,ppk)和外切聚磷酸酶(ex-opolyphosphatase,PPX)的生化性质和结构也进行了总结。同时,结合我们的研究工作,重点分析了结核分枝杆菌中PPX的同源蛋白和可能的生物化学活性。