siRNA干扰HIF-1α抑制人外周血内皮祖细胞分化

背景与目的:低氧诱导因子鄄1α(hypoxiainduciblefactor鄄1alpha,HIF鄄1α)在促血管新生中起关键作用,通过基因沉默方法研究促肿瘤发展因子对细胞分化的影响可为体内抗癌治疗提供指导。本研究构建了HIF鄄1α的RNA干扰(RNAi)质粒,在体外研究其对人外周血内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells,EPCs)向血管内皮细胞(endothelialcell,EC)分化的影响。方法:质粒重组技术构建siRNA鄄HIF鄄1α质粒,电穿孔转染质粒,计算转染效率;RT鄄PCR法检测HIF鄄1α、HIF鄄1β及血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)mRNA在质粒转染前后含量变化;免疫组化方法检测在常氧/低氧下和siRNA鄄HIF鄄1α质粒转染后12hHIF鄄1α蛋白表达情况;流式细胞术测定FITC鄄CD31+的EPCs/EC在各组细胞转染3～10天后的组间差异;一氧化氮酶法鉴定各组细胞VEGF依赖性一氧化氮合酶(endothelialnitricoxidesynthase,eNOS)含量;镜下观察转染前后细胞形态及分化程度。结果:重组子质粒测序鉴定证实siRNA鄄HIF鄄1α构建与设计相符,电转效率约20%;转染6h各组HIF鄄1αmRNA在常氧中及低氧中均表达,并可被siRNA鄄HIF鄄1α不同程度抑制(P<0.05),相应的下游靶基因VEGF表达下调(P<0.05),HIF鄄1β表达在各组中无显著性差异(P>0.05)。免疫组化示常氧及低氧1hHIF鄄1α蛋白无表达,低氧3h成倍出现,6h达高峰,24h降至基线水平;siRNA鄄HIF1α抑制后低氧12h,HIF鄄1α蛋白表达被显著抑制。流式细胞仪检测发现,经siRNA鄄HIF鄄1α抑制后CD31+细胞较对照组在常氧及低氧中表达下调(P<0.05)。siRNA减少eNOS含量,并与培养时间及VEGF刺激浓度呈反比(P<0.01)。细胞形态学观察示低氧可诱导并加速EPCs向EC定向分化、扩增,但可被siRNA鄄HIF鄄1α抑制。结论:固有的或低氧诱导的HIF鄄1α表达足以影响下游靶基因表达,siRNA能抑制促血管新生的靶基因,抑制EPCs向EC分化。

不同剂量阿托伐他汀钙治疗对冠心病患者外周血内皮祖细胞的影响

目的探讨不同剂量阿托伐他汀钙治疗对冠心病患者外周血内皮祖细胞(EPC)的影响。方法选取自2013年1月至2015年1月收治的冠心病患者96例,用随机数表法分为观察组和对照组,每组48例。两组患者均给予阿托伐他汀治疗,对照组40 mg/d,观察组20 mg/d,疗程为8周。分别观察用药前(用药后0 h)及用药后6 h、18 h、36 h、60 h、108 h、150 h等时段EPC增殖、迁移及黏附能力。结果两组患者的EPC增殖情况均呈波浪状分布,在72 h时达到最大值,72 h之前对照组的增幅大于观察组(P<0.05),72 h之后两组增长程度差异无显著性(P>0.05);黏附情况比较,观察组在108 h时达到最大值,至150 h时维持较稳定状态,对照组72 h时达到最大值,之后下降明显,较长时间应用大剂量阿托伐他汀对EPC的黏附能力无较大提升,差异无显著性(P>0.05);两组患者的EPC迁移情况均呈波浪状分布,在72 h时达到最大值,72 h之前对照组的增幅大于观察组(P<0.05),72 h之后对照组下降明显,较长时间应用大剂量阿托伐他汀对EPC的迁移能力无较大提升,差异无显著性(P>0.05)。结论使用20 mg/d或40 mg/d剂量的阿托伐他汀钙药物治疗可对EPC均有一定增殖作用,但较长时间的检测表明,应用大剂量(40 mg/d)阿托伐他汀钙对EPC的增殖、黏附和迁移能力无较大提升。

妊娠期糖尿病患者血清镁离子、铬离子、血管内皮细胞黏附分子-1及外周血内皮祖细胞检测的临床意义

目的妊娠期糖尿病(GDM)患者血清镁离子、铬离子、血管内皮细胞黏附分子-1(VCAM-1)及外周血内皮祖细胞(EPCs)检测的临床意义。方法回顾性选取2019年8月至2020年12月河北省人民医院产科收治的168例妊娠期糖尿病患者作为GDM组。同时选取165例正常孕妇作为对照组。抽取静脉血测定血清镁离子、铬、钙、磷离子,VCAM-1及外周EPCs数量,同时测定高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、载脂蛋白A(APOA)、载脂蛋白B(APOB)等生化指标。受试工作曲线(ROC)分析血清镁离子、铬离子水平、VCAM-1浓度及外周EPCs含量与发生不良妊娠结局的关系。结果观察组患者血清镁及铬分别为(0.52±0.08)nmol/L及(0.20±0.04)μmol/L,均显著低于对照组[(0.88±0.12)nmol/L、(0.38±0.06)μmol/L],差异均有统计学意义(P<0.05)。观察组患者血清TG及VCAM-1水平为(2.21±0.62)mmol/L、(356.33±26.99)mg/dL,显著高于对照组[(1.57±0.48)mmol/L、(295.67±24.56)mg/dL],差异均有统计学意义(P<0.05),而TC、ApoAl、HDL-C、LDL-C及ApoA1水平差异无统计学意义(P>0.05)。观察组患者EPCs百分比数为(0.042±0.011)%,EPCs数量为(37.29±4.76)×10^(6) cell,显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。观察组患者不良妊娠结局发生率为30.95%,显著高于对照组的16.97%,差异有统计学意义(P<0.05)。VCAM-1及外周血内皮祖细胞含量预测发生不良妊娠结局的ROC曲线AUC分别为0.632及0.673,且敏感度和特异性优于血清镁离子和铬离子。结论GDM患者血清镁离子、铬离子水平及外周血内皮祖细胞含量较正常妊娠孕妇显著降低,VCAM-1水平明显上升,且VCAM-1和EPCs含量对评估GDM妊娠结局有一定的指导意义,可辅助诊断、预测不良妊娠结局发生情况。

老年急性脑缺血患者外周血内皮祖细胞数量的变化

脑卒中患者多发现有血管病变。内皮祖细胞（EPCs）是血管内皮细胞的前体细胞。近年来研究发现EPCs在外周血管疾病、心脑血管疾病和创伤愈合等均有重要作用,这为缺血性疾病的研究治疗提供新的思路〔1～3〕。大量动物实验提示EPCs与脑缺血程度以及缺血再灌注有关,且能促进缺血模型老年大鼠神经元功能的恢复〔4〕。本研究旨在检测临床老年缺血性脑卒中患者的外周血EPCs数量和分析其与神经功能的关系。

宁肺活血利水方对慢性阻塞性肺疾病合并肺动脉高压外周血内皮祖细胞计数及功能影响的临床及实验研究

目的分析慢性阻塞性肺疾病(COPD)合并肺动脉高压(PH)患者应用宁肺活血利水方治疗后所产生的效果及影响。方法60例COPD合并肺动脉高压患者,采用随机数字表法分为对照组及研究组,每组30例。对照组进行常规治疗,研究组采用常规治疗+宁肺活血利水方治疗。对比两组患者治疗前后中医证候积分、肺动脉压、外周血内皮祖细胞(EPCs)计数及功能、治疗效果。同时选取30只雄性SD大鼠,随机分为模型组、干预组及空白对照组,每组10只。模型组及干预组于项背部皮下注射1%的野百合碱以诱导形成肺动脉高压模型,空白对照组注射等量磷酸盐缓冲液(PBS)。干预组于第3天开始予以宁肺活血利水方水煎液灌胃,模型组以等量蒸馏水灌胃,空白对照组不进行灌胃治疗。对比三组大鼠右心室收缩压(RVSP)、静脉血EPCs计数及功能。结果临床研究中,治疗后,两组中医证候积分、肺动脉压均较治疗前降低,且研究组中医证候积分(5.46±0.71)分、肺动脉压(37.11±8.07)mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)显著低于对照组的(9.98±1.01)分、(41.83±8.46)mm Hg,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后,两组EPCs计数、EPCs增殖能力、EPCs迁移能力、EPCs粘附能力均较治疗前升高,且研究组高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。研究组的治疗总有效率为93.33%,明显高于对照组的73.33%,差异有统计学意义(P<0.05)。动物实验研究中,空白对照组RVSP低于模型组及干预组,EPCs计数、EPCs增殖数、EPCs粘附能力、EPCs迁移能力高于模型组及干预组,差异有统计学意义(P<0.05);干预组RVSP低于模型组,EPCs计数、EPCs增殖数、EPCs粘附能力、EPCs迁移能力高于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论将宁肺活血利水方应用在COPD合并肺动脉高压的临床治疗中,对于降低患者肺动脉压,改善心肺功能有显著效果,同时也有利于增加外周血EPCs计数,改善血EPCs各项功能,从而可缓解患者病情。

银杏叶提取物对糖尿病患者外周血内皮祖细胞GPX及Caspase-3活性的影响

目的:观察银杏叶提取物(GBE)对2型糖尿病(T2DM)患者外周血内皮祖细胞(EPCs)中谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)及特异性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)表达的影响。方法:取T2DM患者(实验组)和正常人(对照组)外周血分离单个核细胞,在包被有纤维连接蛋白的培养板中加入含血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)等的M199培养基,诱导EPCs分化,48h后去除悬浮细胞,继续培养,于培养第6天加入不同浓度GBE(0mg/L、6.75mg/L、12.50mg/L、25.00mg/L、50.00mg/L)干预24h后,用紫外分光光度计检测培养上清液中GPX活性,用酶标仪检测培养细胞Caspase-3活性。结果:相同GBE浓度时,实验组GPX活性较对照组明显降低(P<0.05),Caspase-3活性较对照组明显升高(P<0.05或P<0.01)。结论:GBE对T2DM患者EPCs有保护作用,其机制可能与抗氧化和减少自由基生成有关。

封闭式负压引流对轻中度缺血糖尿病足溃疡患者外周血内皮祖细胞数量的影响

目的探讨使用封闭式负压引流治疗轻中度缺血糖尿病足溃疡的疗效及对患者外周血内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)数量变化的影响。方法将2018年1月至2018年12月本院收治的60例轻中度缺血糖尿病组溃疡患者作为研究对象,随机分成实验组(n=30)与对照组(n=30),对照组患者进行常规控制血糖、血脂及创面清除治疗,实验组则实施封闭式负压引流的治疗方法。对两组患者的疗效进行观察比较,同时在治疗前后对患者EPCs数量变化进行观察。结果实验组患者治疗总有效率为96.67%,明显高于对照组80.00%的总有效率(P<0.05);治疗2 w及治疗1个月后,两组患者EPCs数量均较治疗前增加,然而实验组增加幅度明显要比对照组更显著(P<0.05)。结论针对轻中度缺血糖尿病足溃疡者,应用封闭式负压引流的治疗方法,可取得更显著的治疗效果,同时还可以显著提高患者EPCs指标水平,值得推广。

肝细胞生长因子对体外培养冠心病患者外周血内皮祖细胞生物学功能的影响

目的探讨肝细胞生长因子(HGF)对体外培养冠心病患者外周血内皮祖细胞(EPCS)生物学功能的影响。方法选取2014年1月至2014年9月就诊的冠心病患者16例作为研究组,同时期未患有冠心病的健康体检者16例作为对照组。每组又均再随机分为HGF组和非HGF组。观察并比较两组患者外周血中CD133+细胞数量、血浆中HGF含量以及EPCS生物学功能。结果研究组患者CD133+细胞数量显著低于对照组患者(P<0.05);研究组患者HGF含量显著高于对照组患者(P<0.05)。研究组非HGF干预增殖能力吸光度、粘附细胞数和迁移细胞数均显著低于对照组非HGF干预组(均P<0.05)。研究组患者中HGF干预组增殖能力吸光度、粘附细胞数和迁移细胞数均显著高于非HGF干预组(均P<0.05)。对照组患者HGF干预组增殖能力吸光度显著高于非HGF干预组(P<0.05),粘附细胞数和迁移细胞数比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论 HGF可显著增强冠心病患者外周血中EPCs增殖、粘附和迁移等生物学功能。

进展性脑梗死患者外周血内皮祖细胞的变化及临床意义

目的探讨进展性脑梗死患者外周血内皮祖细胞的变化及其临床意义。方法选取2016年3~12月期间沧州市人民医院收治的65例进展性脑梗死患者为A组,65例完全性脑梗死患者为B组,65例健康同龄者为C组,检测并比较三组受检者的外周血内皮祖细胞,同时比较A组和B组患者中不同NIHSS评分患者的检测结果,将A组中不同时间点的检测结果也进行比较。结果 A组患者的外周血内皮祖细胞CD34、CD34/CD133、CD34/KDR及KDR分别为(13.36±1.52)%、(6.98±0.78)%、(4.82±0.45)%及(30.64±2.42)%,均低于B组的(21.52±1.99)%、(14.64±1.56)%、(9.32±0.78)%、(38.98±2.90)%及C组的(30.78±2.56)%、(20.52±1.96)%、(15.45±1.22)%、(50.45±3.62)%,B组则低于C组,差异均有统计学意义(P<0.05);A组患者中不同NIHSS评分患者的上述各项外周血内皮祖细胞检测结果均低于B组中相同NIHSS评分患者,差异均有统计学意义(P<0.05),且A组患者发病后第2、5及7天时的外周血内皮祖细胞检测结果明显低于其他时间点检测结果,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论进展性脑梗死患者外周血内皮祖细胞呈现低表达状态,且神经缺损越严重的患者其表达水平越低,对其表达的监测有助于临床做出诊断及治疗措施的制定。

降糖治疗对老年冠心病合并糖尿病患者外周血内皮祖细胞影响的研究

目的通过观察降糖治疗对老年冠心病合并糖尿病患者外周血内皮祖细胞数量和功能的影响,为老年冠心病合并糖尿病患者的动脉粥样硬化治疗寻求新措施。方法以我院2012年4月-2013年1月接收诊治的47例老年冠心病合并糖尿病患者为降糖治疗组,45例健康者为对照组,采用流式细胞仪、DiI-ac-LDL和FITC-UEA-I免疫荧光双染法和MTT比色法等进行鉴定计数、增殖功能、黏附功能和迁移功能检测,比较两组外周血内皮祖细胞数量与功能的差别,并且比较降糖治疗组治疗前后外周血内皮祖细胞的数量及功能的变化。结果降糖治疗组治疗前外周血内皮祖细胞数量和增殖、黏附和迁移功能均低于对照组,降糖治疗后与治疗前相比,CD34、CD133、VEGFR2、vWF、CD34/CD133细胞数量增加,增殖、迁移功能增强,差异均具有统计学意义(P<0.05),治疗后外周血内皮祖细胞数量和增殖、迁移功能扔低于对照组,有统计学差异(P<0.05),黏附功能与治疗前和对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05)。结论老年冠心病合并糖尿病患者存在外周血内皮祖细胞数量减少及增殖、黏附和迁移功能的缺失,降糖治疗对体内受损的内皮祖细胞具有改善作用,有利于减缓冠状动脉粥样硬化进程。

兔外周血内皮祖细胞的分离培养及鉴定

内皮细胞（EC）构成正常的血管壁，内皮祖细胞（EPCs）是EC的前体细胞，可在体内、外分化为成熟EC。本研究以新西兰兔外周血为研究对象，探索分离、培养、扩增EPCs的方法，以期为细胞治疗为主的血管性疾病治疗提供实验基础。

冠心病患者与健康人群外周血中内皮祖细胞微小RNA表达

目的探讨健康人群和冠心病患者外周血中内皮祖细胞微小RNA(miRNA)的表达水平。方法选择冠心病患者60例为冠心病组,同期健康体检者60例为对照组,研究对象均行实时荧光定量PCR检测外周血中内皮祖细胞miRNA-21、miRNA-150的表达水平;采集10 ml肘静脉血,密度梯度离心法得到单个核细胞,培养采集贴壁细胞,予以激光共聚焦显微镜鉴定,评估冠心病组、对照组外周血内皮祖细胞的数目、迁移能力、增殖能力、黏附能力;比较冠心病组、对照组血清肌酸激酶(CK)、CK同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白(cTn)I水平。结果冠心病组外周血中内皮祖细胞miRNA-21、mi-RNA-150表达水平显著高于对照组(P<0.01),外周血内皮祖细胞数目、迁移能力、增殖能力、黏附能力与对照组相比显著下降(P<0.01)。冠心病组的CK、CK-MB、cTnI水平与对照组比较显著降低(P<0.01)。结论冠心病病人外周血中内皮祖细胞的数目较少,生成血管能力、迁移、黏附、增殖能力损伤,表达多种miRNA水平差异显著。

人外周血内皮祖细胞的分离培养和鉴定

内皮祖细胞（EPC）可促进血管生成及组织修复。很多学者用外周血单个核细胞（PBMNC）来源的EPC作为标准，揭示具有典型免疫标志的细胞的病理生理学特性，但对EPC的定义却并不明确。我们对此进行了研究。

外周血来源的间充质干细胞与内皮祖细胞体外构建血管化组织的研究

目的利用两种外周血细胞在体外构建出血管样组织。方法从外周血提取内皮祖细胞与间充质干细胞并鉴定,在纤维蛋白凝胶中以不同的密度培养,在显微镜下观察至第7天。结果兔外周血可以提取出内皮祖细胞与间充质干细胞,内皮祖细胞与间充质干细胞的比值为100万/m L:200万/m L时可以在体外形成血管样结构。结论外周血中可以提取出特定细胞并在体外共培养形成血管样组织。

IgA肾病患者外周血内皮祖细胞的检测及意义

lgA肾病（IgAN）在我国原发性肾小球肾炎中。是导致慢性肾衰竭的首位病因。IgAN的病理特点是肾小球系膜细胞增生和系膜外基质增多。由于系膜区与毛细血管袢内皮“接连接无基底膜的特点，当系膜基质与系膜细胞发生免疫炎性反应时，会直接导致内皮细胞的损 伤，甚至坏死。

低氧诱导因子促内皮祖细胞活性的可行性研究

目的探讨在体外低氧诱导因子-1α(H IF-1α)促血管内皮祖细胞(EPCs)成血管活性的可行性。方法密度梯度法分离人外周血EPCs,电穿孔技术转染H IF-1α质粒至EPCs,RT-PCR法观察未转染/转染质粒在转染后3、12、20、72 h,H IF-1α及下游靶基因血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达含量的变化;免疫组化法检测常氧中转染前后H IF-1α蛋白表达、VEGF受体F lk-1蛋白表达在不同组质粒转染后的差异;ELISA法测定各组质粒转染后VEGF在培养基上清中释放含量及VEGF依赖性一氧化氮合成酶(eNOS)含量的改变。结果H IF-1α基因有效转染入EPCs;H IF-1αmRNA在未转染时即有表达,在H IF-1α质粒转染后3、12、20、72 h,含量较未转染时增加(P<0.05);H IF-1α过表达诱导VEGF表达上调(P<0.05)。F lk-1蛋白在常氧下有一定含量,在H IF-1α质粒转染后F lk-1蛋白表达进一步增加。VEGF释放含量在H IF-1α过表达组显著增加(P<0.05);H IF-1α诱导eNOS含量增加,并与时间、VEGF刺激量成正比。结论H IF-1α质粒在体外能有效的转染入EPCs,促进其下游靶基因及受体表达,引起相应的功能学改变,促EPCs向内皮细胞分化、扩增,可进一步应用于基因治疗。

妊娠期高血压疾病患者血清硒及内皮祖细胞检测的意义及与妊娠结局的关系

目的 探讨妊娠期高血压疾病(HDCP)患者血清硒、血管内皮生长因子(VEGF)及外周血内皮祖细胞的检测意义及与妊娠结局的关系。方法 选取2016年10月—2018年10月在河北省人民医院产科门诊就诊的HDCP孕妇60例为HDCP组,另取同期就诊的正常妊娠孕妇60例为正常组。比较2组孕妇血清硒、VEGF水平及外周血内皮祖细胞百分比和不良妊娠结局,Logistic回归分析血清硒、VEGF水平及外周血内皮祖细胞百分比与不良妊娠结局的关系。结果 HDCP组孕妇血清硒、VEGF水平及外周血内皮祖细胞百分比均明显低于正常组(P均<0.05)。HDCP组胎儿窘迫及早产发生率均明显高于正常组(P均<0.05),2组产后感染、产后出血、胎膜早破发生率比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。血清硒水平与胎儿窘迫、早产的发生无明显相关性(P均>0.05),血清VEGF水平是发生胎儿窘迫和早产的保护因素[OR分别为0.976和0.974,95%CI分别为(0.957,0.995)和(0.953,0.995),P均<0.05];外周血内皮祖细胞百分比是发生胎儿窘迫的保护因素[OR为0.807,95%CI为(0.655,0.995),P<0.05],与早产的发生无明显相关性(P>0.05)。结论 HDCP孕妇血清硒、VEGF水平及外周血内皮祖细胞百分比较正常妊娠孕妇显著降低,血清VEGF水平和外周血内皮祖细胞百分比与HDCP孕妇妊娠结局有相关性,可辅助预测不良妊娠结局发生情况。

氨氯地平联合阿托伐他汀对慢性心力衰竭合并高血压、糖尿病患者血管内皮舒缩因子、外周血EPC数量的影响

目的研究氨氯地平联合阿托伐他汀钙片对冠心病慢性心力衰竭合并高血压、糖尿病患者血管内皮舒缩因子、外周血EPC数量的影响。方法选取2017年1月至2018年2月收治的冠心病慢性心力衰竭合并高血压、糖尿病患者120例,患者根据随机数字表法分为观察组和对照组,每组60例。对照组采用氨氯地平治疗,观察组在氨氯地平的基础上联合阿托伐他汀钙片治疗,分析2组患者治疗前后的血管内皮舒缩因子水平、外周血内皮祖细胞(EPC)数量和血脂水平,并对比治疗效果。结果2组治疗前NO和ET-1水平差异无统计学意义(P>0.05);治疗后,观察组NO水平明显高于对照组,ET-1水平明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);治疗后观察组的外周血EPC数量明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);2组治疗前的各项血脂水平差异无统计学意义(P>0.05),治疗后,观察组TG、TC和LDL-C水平明显低对照组,HDL-C水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),且观察组治疗后相较于治疗前,TG、TC和LDL-C水平均明显降低,HDL-C水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);2组的血压控制有效率差异有统计学意义(P<0.05)。结论对于冠心病慢性心力衰竭合并高血压、糖尿病患者,相比于单独使用氨氯地平,联合使用阿托伐他汀钙能够更有效地改善血管舒缩因子失衡,显著提高外周血EPC数量,起到更好的血管保护作用,同时也能有效调节患者的血脂水平和控制患者血压。