外周血基因转录本检测中2种标本处理方法的比较

目的 选择合理的标本处理方法 ,提高外周血基因转录本检测的灵敏度。方法 5 3例胃癌患者外周血标本分别以淋巴细胞分离液 (FICOLL)和红细胞裂解液 (RLS)处理后提取RNA ,以荧光定量RT PCR技术检测 β actin基因和CEA基因转录本。 结果 RLS法和FICOLL法定量检测 5 3例外周血标本的 β actin基因转录本的平均浓度分别为 1.19× 10 6和 2 .4 0× 10 5拷贝 /ml,2组测定值差异有显著性 (P <0 .0 1)。RLS法检测 5 3例中 13例为CEAmRNA阳性 ,阳性率为 2 4 .5 % ;FICOLL法检测到 5例阳性 ,阳性率 9.4 % ,RLS法的阳性检出率高于FICOLL法 (P <0 .0 5 )。结论 RLS法分离外周血有核细胞的效果优于FICOLL法 ,有利于提高基因表达检测的灵敏度。

基于转录组测序筛选多囊卵巢综合征外周血中差异表达基因及miRNA

目的:基于转录组测序并结合生物信息学技术分析多囊卵巢综合征(PCOS)患者与健康人群全血样本来源的微阵列数据,筛选差异表达基因及miRNA,为PCOS的临床诊疗提供新见解。方法:从GEO数据库筛选并下载GSE54248数据集,利用R软件limma包筛选PCOS组与对照组的差异表达基因,并对其进行GO和KEGG富集分析。使用在线分析工具STRING数据库用于分析蛋白质-蛋白质相互作用,并通过Cytoscape构建PPI互作网络,使用CytoHubba插件中的MCC、Degree、Closeness、Bottleneck四种算法计算后取交集识别Hub基因。通过NetworkAnalyst构建Hub基因的靶向miRNA网络图。qRT-PCR法检测PCOS组及对照组外周血中IL-1β、FCGR3A、CD79B、CD27和CD52表达。结果:从GSE54248数据集中共筛选鉴定出98个差异表达基因,其中55个上调基因,43个下调基因。GO富集分析表明,差异基因生物学过程主要集中于蛋白质自身磷酸化、白细胞介导的免疫、淋巴细胞介导的免疫、免疫反应调节信号通路等。KEGG显著富集了3个信号通路,分别为原发性免疫缺陷、造血细胞系及Th17细胞分化。结合PPI网络与CytoHubba的四种算法的结果,得到了IL-1β、FCGR3A、CD79B、CD27和CD52这5个Hub基因。结合miRNA-靶基因的共表达网络,有5种miRNAs,包括hsa-miR-375、hsa-miR-34a-p、hsa-miR-126-3p、hsa-miR-146a-5p及hsa-miR-449a等被预测可能是PCOS患者外周血中关键的miRNA分子。qRT-PCR结果证实,与对照组相比,PCOS组患者外周血中IL-1β表达升高(P<0.05),FCGR3A、CD79B、CD27表达均显著升高(P<0.01)。结论:本研究通过公共数据库挖掘鉴定出IL-1β、FCGR3A、CD79B、CD27可能作为关键基因参与PCOS的病理生理过程,并通过生物信息学分析鉴定了5个可能调控PCOS的miRNA。该结果将为进一步阐明PCOS的发生发展机制提供新思路,也将为PCOS提供新的药物靶点和诊疗思路。

SYBR荧光实时定量PCR检测非小细胞肺癌组织与外周血中RRM1和ERCC1及BRCA1基因表达水平

目的:建立荧光实时定量PCR技术,检测非小细胞肺癌组织与外周血RRM1和ERCC1及BRCA1基因表达水平。方法:分别构建RRM1、ERCC1和BRCA1及管家基因β-actin质粒标准品,以SYBR荧光实时定量PCR分析,制备标准曲线,对非小细胞肺癌组织与外周血中RRM1、ERCC1和BRCA1及管家基因β-actin的mRNA进行检测。结果:标准曲线呈良好的线性关系。标准品的熔解曲线均呈单峰,特异性良好,说明基本无非特异性扩增。结论:所建SYBR荧光实时定量PCR方法操作简便,费用低,特异性好,准确度、灵敏度高,为后续研究构建了理想的平台。

血型血清学检测在急性白血病病人非清髓异基因外周血干细胞移植中的意义

为了探讨ABO血型不合的急性白血病非清髓性异基因外周血干细胞移植中红细胞血型血清学检测的临床意义 ,采用红细胞凝集试验方法检测供、受者ABO和MN血型 ,用DianaGelphenotypeRh卡检测Rh血型。移植后观察受者血型和红细胞凝集素效价变化以及用STR PCR方法监测供者细胞植入情况。结果显示 ,4例受者中 2例供者细胞混合嵌合伴血型嵌合 ,其中 1例在移植后 1 0 0天转为完全嵌合 ,血型亦转为供者型。另 2例受者细胞呈供、受混合嵌合体 ,但血型未见转变 ,其中 1例在移植后 1 54天出现移植排斥。红细胞凝集素效价检测显示 ,受者红细胞凝集素效价高者 ,供者细胞植入率低 ,血型不易嵌合。反之 ,效价低者 ,供者细胞植入率高 ,血型易嵌合。结论 :在非清髓外周血干细胞移植 (NAPBSCT)中红细胞血型血清学检测可间接反映移植效果 ,协助确定临床预处理方案和移植后免疫抑制治疗的强度 ,估计预后 。

荧光定量RT-PCR检测急性白血病患者外周血WT1基因的表达

目的 了解急性白血病患者外周血WT1基因的表达水平。方法 建立荧光定量RT -PCR方法 ,用PEABI 770 0PCR仪检测 114例急性白血病患者、2 6例非白血病患者和3 6例正常人外周血中WT1基因的表达水平。结果 2 2例急性髓系白血病 (AML)和 15例急性淋巴细胞白血病 (ALL)初发患者WT1基因的表达量为 10 5～ 10 6拷贝 / μgRNA ,取得部分缓解的 2 6例AML和 19例ALL患者的表达水平为 10 2～ 10 4拷贝 / μgRNA ,而取得完全缓解的 17例AML和 13例ALL患者的表达水平为 0～ 10 2拷贝 / μgRNA。 结论 WT1基因在白血病外周血中有高水平的表达 ,可作为急性白血病疗效考核及监测微残留病的指标。

生理状态下外周血白细胞IL-2基因表达的荧光定量PCR检测

目的:建立白细胞介素2(IL-2)基因表达的绝对定量实时PCR检测技术。方法:应用实时定量PCR方法检测25名健康运动员中IL-2mRNA的表达。主要结果和结论:应用实时定量PCR方法能够对健康受试者外周血白细胞自发性IL-2mRNA表达进行定量分析,相关系数r>0.99。

孕妇外周血中胎儿γ血红蛋白基因的检测

目的 探索检测孕妇外周血中胎儿γ血红蛋白基因表达的方法。方法 提取孕妇全血mRNA ,经体外逆转录后 ,用反转录聚合酶链反应 (RT PCR)方法 ,应用ε/γ特异引物引导扩增胎儿ε/γ血红蛋白基因 ,以NdeⅡ酶切后 ,经琼脂糖凝胶电泳 ,在凝胶成像系统下观察。结果 成功自孕妇外周血中扩增出胎儿ε/γ血红蛋白基因 ,ε/γ基因被NdeⅡ酶切成三个γ基因片断 ,大小分别为 191、5 7和 2 6bp。结论 孕妇全血中微量的胎儿mRNA已基本满足体外逆转录及扩增的要求 ,胎儿γ血红蛋白基因的检测可为无创伤性产前诊断的发展奠定基础。

晚期非小细胞肺癌外周血EGFR基因检测与肿瘤抗原标志物临床价值

目的:探究原发性非小细胞肺癌(NSCLC)患者外周血EGFR基因检测与肿瘤抗原标志物临床价值。方法:选取本院2017-09~2018-09收治的NSCLC患者中的80例作为本次研究对象,均检测患外周血的EGFR基因以及血液肿瘤抗原标志物的表达情况,对两者检测结果进行评价分析。结果:EGFR基因突变检测结果中,阳性33例、阴性47例,基因突变率41.25%。EGFR基因突变情况多见于肺腺癌与女性患者(P<0.05);EGFR基因突变阳性患者的CEA值显著高于EGFR基因突变阴性(野生型)患者(P<0.05),而SCCAg值则显著低于EGFR基因突变阴性患者(P<0.05);EGFR基因突变阳性患者的CYFRA21-1、CA-125以及NSE表达水平与EGFR基因突变阴性患者的对比均为见显著差异(P>0.05)。结论:血清中肿瘤抗原标志物CEA浓度水平的升高、SCCAg表达水平下降与EGFR基因突变存在相关性,对血清CEA与SCCAg的检测可对EGFR基因突变的预测起到一定的效果,临床可结合优势人群选择使用EGFR-TKIs进行治疗,临床行血浆EGFR基因检测具有较高的实用价值。

利用逆转录酶的聚合酶链式反应检测外周血中的肿瘤细胞

本文就RT-PCR技术检测外周血中肿瘤细胞的基本原理及其在黑色素瘤、肝癌、乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌等检测中的应用加以综述。

巢式逆转录聚合酶链反应检测肝癌患者外周血AFP mRNA的临床意义

目的 评估肝细胞癌 ( HCC)患者外周血甲胎蛋白 m RNA( AFP m RNA)检测的临床意义。方法 采用巢式逆转录聚合酶链反应技术 ,对肝癌患者外周血 AFP m RNA进行检测。结果 37例肝癌患者中 AFP m RNA阳性 16例 ( 4 3.2 % ) ,2 5例肝硬变患者中 AFP m RNA阳性 2例 ( 8.0 % ) ,2 0例正常对照无 1例阳性 ;AFP m RNA阳性的 HCC患者肝外转移发生率 ( 87.5 % )显著高于 AFP m RNA阴性的 HCC患者 ( 33.3% ) ,差异有显著性 (χ2 =10 .85 6 ,P≤ 0 .0 0 1,OR=14 .0 0 ,95 %可信区间 CI=2 .4 6 4～ 79.5 5 0 ) ;不同临床分期的 HCC患者其 AFP m RNA检出率不同 , 期患者检出率 ( 6 1.9% )明显高于 、 期检出率 ( 18.8% ) ;AFP m RNA的检出率与血清 AFP水平不同无明显相关。结论 巢式 RT- PCR方法是检测外周血残癌细胞 AFP m RNA的一种灵敏可靠技术 ,检测外周血中的 AFP m

Maspin基因在乳腺癌骨髓和外周血微小转移检测中的应用价值

目的:研究Maspin基因在乳腺癌患者骨髓和外周血微小转移检测中的应用价值以及骨髓和外周血Maspin mRNA表达与乳腺癌临床病理因素之间的相关性。方法:采用巢式逆转录-聚合酶链反应检测10例良性乳腺疾病患者和41例乳腺癌患者骨髓及外周血中Maspin mRNA的表达。结果:在10例对照组骨髓和外周血中均未检测出Maspin mRNA,而在乳腺癌患者骨髓和外周血中分别有15例(36.6%)和16例(39%)检测到Maspin mRNA。骨髓和外周血中Maspin mRNA检测结果的符合率为87.8%,检测结果有相关性(χ2=22.563,P=0.000,R=0.742)。乳腺癌患者骨髓和外周血中Maspin mRNA表达率随病理分期升高、淋巴结转移、临床分期进展而升高,但均无显著性差异。如将患者按复发风险分组,高危组患者骨髓和外周血中Maspin mRNA表达率明显升高,但仅在骨髓中显示有显著性差异(χ2=6.621,P=0.037),而在外周血中无显著性差异(χ2=5.904,P=0.052)。结论:Maspin基因用于乳腺癌患者骨髓和外周血微小转移的检测具有很高的特异性,乳腺癌患者骨髓和外周血中Maspin mRNA表达可能与高危复发风险相关。

外周血单个核细胞内乙型肝炎病毒基因的检测及临床应用

乙型肝炎病毒(HBV)属嗜肝DNA病毒，主要侵犯肝脏，但是目前在许多肝外组织和细胞中，已发现了HBV核酸及其相关抗原。乙型肝炎的发病机制主要与机体免疫状态有关。HBv感染外周血单个核细胞(PBMCs)会直接影响机体的免疫功能，所以对PBMCs内HBV-DNA的检测有重要意义。为此，本室在HBV-preS/S区设计合成了一对核酸引物，采用聚合酶链反应(PCR)方法检测乙型肝炎病毒感染者的血浆及PBMCs内的HBV-DNA，现将结果报告如下。

外周血淋巴细胞中汉坦病毒基因检测对HFRS早期诊断的意义

目的 探讨外周血淋巴细胞中汉坦病毒 (HV)基因的检测对流行性出血热 (又名肾综合征出血热 ,HFRS)早期诊断的意义。 方法 用RT PCR法检测 40例发病 3～ 7日内的HFRS患者外周血淋巴细胞和血浆中的HVRNA ,并与特异性IgM检测结果进行比较。 结果 淋巴细胞中HVRNA阳性率为 82 .5 % (3 3 /4 0 ) ,特异性IgM阳性率为 90 % (3 6/4 0 ) ,两种方法的检出率无显著性差异 (χ2 =3 .2 5 ,P >0 .0 5 ) ,其一致率为 82 .5 % (3 3 /4 0 ) ;血浆中HVRNA阳性率为 5 5 % (2 2 /4 0 ) ,明显低于淋巴细胞 (χ2 =10 .3 7,P <0 .0 1)。 结论 RT

孕妇外周血中胎儿特异性血红蛋白基因的检测与定性分析

目的 :自孕妇外周血中检测胎儿γ血红蛋白基因及探索GelWorks 1D软件应用于PCR扩增产物的定性分析。方法 :提取孕妇全血mRNA ,经体外逆转录后 ,应用ε/γ引物引导扩增胎儿特异血红蛋白基因片段 ,以NdeⅡ内切酶对其酶切 ,经琼脂糖凝胶电泳 ,凝胶成像系统扫描成像 ,用GelWorks 1D软件对凝胶图像进行定性分析。结果 :成功自孕妇外周血中扩增出胎儿ε/γ血红蛋白基因。定性标准曲线公式 :Y =0 0 3 5 92X2 -11 94X + 10 92 ,R2 =0 9978,精确度为 98 6%。ε/γ基因被NdeⅡ酶切成三个γ基因片断 ,大小分别为 191bp、 5 7bp和 2 6bp。结论 :GelWorks 1D软件可以对PCR扩增产物进行定性分析 ,孕妇全血中微量的胎儿mRNA已基本满足体外逆转录及扩增的要求 。

系统性硬化症合并肺间质病变患者外周血单个核细胞全基因组DNA甲基化和转录组表达谱

目的:分析系统性硬化症(systemic sclerosis,SSc)合并肺间质病变(interstitial lung disease,ILD)患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)全基因组DNA甲基化和转录组表达谱,并进一步探讨DNA甲基化对Wnt/β-catenin信号通路和趋化因子信号通路的影响。方法:收集19例SSc患者(SSc组)及18例健康人(对照组)外周血PBMCs。SSc患者中有10例合并ILD(SSc合并ILD亚组)、9例未合并ILD(SSc未合并ILD亚组)。采用Illumina 450K甲基化芯片和Illumina HT-12 v4.0基因表达谱芯片分析全基因组DNA甲基化和基因表达水平,研究DNA甲基化对Wnt/β-catenin和趋化因子信号通路的影响。结果:全基因组DNA甲基化分析发现:与SSc未合并ILD亚组比较,SSc合并ILD亚组存在71个高甲基化位点,98个低甲基化位点。转录组分析发现:与SSc未合并ILD亚组相比,SSc合并ILD亚组有164个基因表达上调,191个基因表达下调。SSc组患者PBMCs中Wnt/β-catenin信号通路中有35个低甲基化基因,其中卷曲同源物1(frizzled-1,FZD1)、丝裂原活化蛋白激酶9(mitogen-activated protein kinase 9,MAPK9)、母亲DPP同源物2(mothers against DPP homolog 2,SMAD2)、转录因子7类似物2(transcription factor 7-like 2,TCF7L2)和无翅型MMTV整合位点家族成员5B(wingless-type MMTV integration site family,member 5B,WNT5B)mRNA在SSc组中的表达显著高于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。与SSc未合并ILD亚组比较,SSc合并ILD亚组中Dickkopf相关蛋白2(dickkopf homolog 2,DKK2)、FZD1、MAPK9等多个基因的mRNA表达虽上调,但差异均无统计学意义(均P>0.05)。趋化因子信号通路中有38个低甲基化基因,其中β-抑制蛋白1(β-arrestin 1,ARRB1)、C-X-C基序趋化因子配体10(C-X-C motif chemokine ligand 10,CXCL10)、C-X-C基序趋化因子配体16(C-XC motif chemokine ligand 16,CXCL16)、FGR、中性粒细胞胞浆因子1C(neutrophil cytosolic factor 1C,NCF1C)mRNA在SSc组中的表达显著高于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。与SSc未合并ILD亚组比较,SSc合并ILD亚组中ARRB1、CXCL10、CXCL16等多个基因的mRNA表达上调,但差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论:SSc合并ILD与SSc无ILD患者存在DNA甲基化和转录组表达谱的差异,且SSc患者PBMCs中存在Wnt/β-catenin和趋化因子信号通路多个基因表达上调,这可能与SSc的发病机制有关。

3例复发性流产患者外周血的基因芯片检测结果初步分析

目前我国将流产定义为妊娠在28周以前,胎儿在1000g以下者,分为自然流产和人工流产。在所有临床确认的妊娠中,自然流产的发生率约为15%,连续2次及2次以上自然流产的发生率为5%。

乳腺小黏蛋白基因在检测乳腺癌病人外周血微转移中的应用价值

目的分析并评价乳腺小黏蛋白(SBEM)基因在检测乳腺癌病人外周血微转移中的应用价值。方法应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析乳腺癌病人、结/直肠癌病人、女性胃癌、乳腺纤维腺瘤病人以及健康人外周血中SBEM基因的表达。结果全部111例乳腺癌病人外周血中有59例SBEM基因表达呈阳性;对照组外周血中SBEM基因未见阳性表达。乳腺癌病人外周血阳性表达率与对照组相比差异显著(P<0.05)。SBEM基因的阳性表达与病人淋巴结转移以及TNM分期之间具有相关性(P<0.01);而与病人年龄大小、病理类型、原发肿瘤体积、雌激素受体以及孕激素受体等无相关性(P>0.05)。结论 SBEM基因在乳腺癌病人的外周血中呈特异性表达,可作为乳腺癌病人外周血中微转移检测以及分析预后的可靠指标之一。

PCR-MASA检测胰腺癌外周血K-ras基因点突变的研究

目的 了解胰腺癌外周血中 K- ras基因点突变检测的临床价值。方法 采用 PCR- MASA法检测胰腺癌患者外周血中 K- ras基因点突变。结果 胰腺癌外周血标本中 K- ras基因点突变率为38.1% (8/ 2 1) ,而所有被检测的急、慢性胰腺炎、胰岛素瘤、壶腹癌、十二指肠乳头癌、胆管癌及胆石症患者外周血标本均无 K- ras基因突变。结论 (1) PCR- MASA方法简捷、特异、敏感 ,扩增产物只需常规电泳、染色即可观察结果 ,无需酶切、杂交、放射性和非放射性显影 ;(2 )对外周血标本检测 K- ras基因第12位密码子有无突变 ,具有临床实用性 ,有助于判断胰腺病变良恶性及胰腺癌的早期诊断。