人外周血血清培养人脐带间充质干细胞定向诱导为神经干细胞

背景:细胞培养基种类甚多,成分不尽相同,对细胞生长影响较大。国内外有多项研究采用无血清、含胎牛血清的培养基进行体外扩增培养,但应用含人外周血血清的培养基将人脐带间充质干细胞定向诱导为神经干细胞以及人外周血血清促进神经干细胞分化为其他神经细胞,目前相关研究较少。目的:观察人外周血血清培养的人脐带间充质干细胞定向诱导为神经干细胞的可行性。方法:①采用含体积分数10%人外周血血清的DMEM/F12培养基培养人脐带间充质干细胞,传代培养至第3代时应用流式细胞仪分析其表面标志物,并通过茜素红染色对其成骨分化能力进行检测;②取第3代人脐带间充质干细胞,加入培养体系为含0.5%N2、1.5%B27、20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和20 ng/mL表皮生长因子的DMEM/F12培养基定向诱导为神经干细胞,对其表面标志物进行鉴定;③取生长状态良好的人脐带间充质干细胞源性神经干细胞,制备成单细胞悬液,均匀接种于96孔板中,加入含体积分数10%人外周血血清的DMEM/F12培养液继续培养8 d后,进行苏木精-伊红染色、微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白免疫荧光染色,检测神经干细胞向其他神经细胞分化情况。结果与结论:①经人外周血血清培养的人脐带间充质干细胞呈漩涡状生长且多层分布,排列有方向性;人脐带间充质干细胞表面高度表达CD44、CD105、CD29、CD73,茜素红染色阳性;②人外周血血清培养的人脐带间充质干细胞可以定向诱导分化为神经干细胞,神经干细胞表面高度表达CD44、CD105、CD29、CD73、Nestin、NF-L、GALC;③神经干细胞诱导分化第8天时,经苏木精-伊红染色后发现其伸出的突起长度较长,分支也较多且邻近细胞之间的突起互相连接,呈典型的神经细胞形态,且微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白免疫荧光染色均呈阳性。结果表明,人外周血血清培养人脐带间充质干细胞可以定向诱导为神经干细胞,在人外周血血清的作用下神经干细胞随着培养时间的延长,可分化为其他神经细胞。

外周血来源间充质干细胞的成骨及成脂诱导分化

目的：目前对于是否存在外周血来源间充质干细胞备受争议。实验拟进一步探讨在皮肤损伤与非损伤条件下,外周血来源间充质干细胞的分离培养及其成骨、成脂多向分化特性。方法：实验于1996-08/1997-11在解放军第四军医大学组织工程研发中心完成。①动物：清洁级SD大鼠24只,随机数字表法分为正常组、创面组,12只/组,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：创面组大鼠麻醉后,背部切去3cm×3cm全层皮肤,建立创伤模型。术后5d,两组大鼠腹主动脉抽血,8mL/只,加入含体积分数为0.1胎牛血清的α-MEM培养基,密度梯度法分离培养外周血来源间充质干细胞。取大鼠双侧股骨、胫骨,全骨髓法分离培养骨髓来源间充质干细胞作为对照。③实验评估：培养至第12天,计数原代培养每1×10^5个外周血单个核细胞所形成的间充质干细胞克隆数。取第3代外周血间充质干细胞,行CD45、CD34、Ⅰ型胶原免疫组织化学鉴定细胞表型;按1×10^4密度接种于12孔板,细胞贴壁后分别换用成骨、成脂诱导液培养,以茜素红、油红染色检测其分化特性。结果：①细胞形态观察：原代培养的外周血来源间充质干细胞呈成纤维样。②克隆形成：外周血来源间充质干细胞形成的克隆数仅为骨髓来源间充质干细胞的1/6-1/8,创面组外周血间充质干细胞形成的克隆数是正常组3-4倍。③细胞表型鉴定：外周血来源间充干细胞CD45、CD34呈阴性,Ⅰ型胶原呈阳性。④成骨及成脂诱导：外周血间充质干细胞成骨诱导后21d出现钙沉积,茜素红染色呈阳性;成脂诱导后14d有少量脂滴出现,油红染色为阳性。结论：①皮肤损伤状态下外周血间充质干细胞克隆数量是正常条件的3-4倍,但仍远低于骨髓来源间充质干细胞的克隆能力。②体外分离培养的外周血间充质干细胞具备成骨、成脂分化特性。

来源于骨髓、外周血与脐带血的间充质干细胞生物学特性比较

背景:间充质干细胞存在于人体多种组织,目前研究报道所用细胞来源单一,培养方法差异大,得出的结果不一致,不能证明分离、培养出的细胞是相同的细胞,难以比较。目的:课题提出在体外培养条件下可对同一个体来源的骨髓、外周血来源间充质干细胞及不同个体脐带血来源间充质干细胞的生物学特性进行比较的理论假设。设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2007-06/2008-12在解放军海军总医院血液科完成。材料:解放军海军总医院血液科造血干细胞移植供者10例,取同一供者的骨髓、外周血细胞,细胞体积分别为20mL与2mL。解放军海军总医院产科10例健康初产妇脐带血细胞,细胞体积为30mL。方法:采用Percoll密度梯度+贴壁法分离骨髓、外周血、脐带血来源的间充质干细胞,加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基。当细胞生长汇合至80%～90%时胰蛋白酶-EDTA消化,制成5×108L-1细胞悬液,计为P0。重复上述操作,即为P1,依此类推P2～P5。主要观察指标:细胞生长形态观察,细胞瑞氏-吉姆萨染色结果,细胞化学染色结果,细胞增殖数量,流式细胞仪检测细胞表面标记。结果:①骨髓间充质干细胞贴壁时间、汇合至50%时间、汇合至80%时间均早于外周血、脐带血间充质干细胞;骨髓间充质干细胞培养5～7d时呈漩涡状生长,而外周血、脐带血间充质干细胞无此生长特性。②初始培养和传代培养后,骨髓间充质干细胞多为成纤维样细胞,仅有少量内皮样细胞;而传至第5代的外周血、脐带血间充质干细胞除有成纤维样细胞外,还有较多的内皮样细胞和单核-巨噬样细胞。③P1～P5骨髓、外周血及脐带血来源间充质干细胞PAS染色、碱性磷酸酶染色、苏丹黑B染色均呈阴性。④与P0细胞比较,传代培养至P5后骨髓间充质干细胞增殖数量明显多于外周血、脐带血间充质干细胞(P<0.05)。⑤CD29,CD44,CD90,CD71,CD105,CD166和HLA-ABC阳性率,骨髓间充质干细胞接种后≤6%,P0～P5为55.9%～92.8%;外周血间充质干细胞接种后≤10%,P0～P5为19.7%～33.4%;脐带血间充质干细胞接种后≤20%,P0～P5为35.4%～93.2%。CD34,CD45和HLA-DR阳性率,3种来源的间充质干细胞均极低。CD14,CD31阳性率,骨髓间充质干细胞极低,外周血间充质干细胞为12.1%～28.3%,脐带血间充质干细胞为8.1%～21.3%。结论:结果显示在体外培养条件下,骨髓、外周血和脐带血均能较好地形成间充质干细胞,以骨髓来源的间充质干细胞含量最高,成分单一,而脐带血和外周血含量次之,细胞成分多。

颌骨来源骨髓间充质干细胞成骨分化的特点、优势与应用

背景:颌面部骨组织缺损修复是目前研究的热点与难点,而种子细胞的选择是关键。颌骨来源骨髓间充质干细胞是存在于颌骨内的成体间充质干细胞,在颌面部组织再生方面的应用更具优势。目的:综述颌骨来源骨髓间充质干细胞的生物学特性和成骨分化优势以及药物、体内环境、微小RNA对其成骨分化影响的相关研究进展。方法:利用计算机在PubMed和中国知网进行文献检索。中文检索词为“口腔,骨组织工程,干细胞”,英文检索词为“oral,bone tissue engineering,stem cells”。共检索下载文章405篇,根据纳入与排除标准对文章进行筛选,最终纳入70篇文献进行综述。结果与结论:颌骨来源骨髓间充质干细胞是口腔骨组织工程的优良种子细胞,与长骨骨髓间充质干细胞相比,颌骨来源骨髓间充质干细胞具有更强的增殖能力和成骨分化能力。药物、体内环境、微小RNA均可以调控颌骨来源骨髓间充质干细胞的成骨分化,但目前对颌骨来源骨髓间充质干细胞的研究尚处于初始阶段,因此需要更多论证力较强的研究来证实其在颌面部骨组织再生领域的应用更具优势。

表皮生长因子对外周血间充质干细胞原代克隆形成的影响及其传代后多向分化潜能

背景:目前已有很多实验证明外周血中存在间充质干细胞,但由于所用分离筛选方法、培养条件的不同导致了结果的多样性,且实验可重复性较差。目的:观察表皮生长因子对体外分离培养的原代小鼠外周血间充质干细胞克隆形成的影响,以及外周血间充质干细胞传代后的多向分化潜能。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-10/2008-09在南京医科大学骨与干细胞研究中心完成。材料:雄性成年C57BL/6J小鼠16只,购于南京医科大学骨与干细胞研究中心实验动物中心。重组人表皮生长因子为Sigma公司产品。方法:无菌条件下从小鼠心脏采血,裂解红细胞后应用贴壁法分离外周血间充质干细胞,通过传代进行纯化和扩增。将原代细胞分2组进行体外培养,实验组向α-MEM培养液中加入10μg/L表皮生长因子,对照组给予不含表皮生长因子的α-MEM培养液,16d后行亚甲基蓝染色,计算克隆面积。取第3代外周血间充质干细胞,以1×104/cm2密度接种后,分别向成骨和脂肪方向诱导分化。主要观察指标:外周血间充质干细胞的生长特性,外周血间充质干细胞体外诱导成骨、成脂能力。结果:倒置相差显微镜下,外周血间充质干细胞贴壁生长,形态类似于骨髓间充质干细胞,呈成纤维细胞样;但其形成克隆的时间较骨髓间充质干细胞有所推迟,且原代细胞克隆形成率低于骨髓间充质干细胞;亚甲基蓝染色结果示实验组外周血间充质干细胞克隆形成率明显高于对照组(P<0.05)。外周血间充质干细胞成骨诱导后,碱性磷酸酶染色、总胶原染色及茜素红染色均呈强阳性;成脂诱导后油红染色呈阳性,有一定数量的脂滴形成。结论:外周血中存在少量的间充质干细胞,能自我增殖,表皮生长因子可有效促进原代外周血间充质干细胞克隆的形成;体外分离培养的外周血间充质干细胞具备成骨和成脂分化特性。

外周血来源间充质干细胞研究进展

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)由于具有多向分化能力,在一定条件下可形成骨、软骨、肌肉、肌腱、神经、脂肪、支持造血的骨髓基质及肺、脾、胸腺等组织的基质等,而且MSCs是良好的基因治疗载体,因此备受关注.然而,外周血中的MSCs研究较少,远没有外周血中的造血干细胞和骨髓中的MSCs研究深入,故本文就外周血间充质干细胞的研究进展进行综述.

外周血来源的间充质干细胞与内皮祖细胞体外构建血管化组织的研究

目的利用两种外周血细胞在体外构建出血管样组织。方法从外周血提取内皮祖细胞与间充质干细胞并鉴定,在纤维蛋白凝胶中以不同的密度培养,在显微镜下观察至第7天。结果兔外周血可以提取出内皮祖细胞与间充质干细胞,内皮祖细胞与间充质干细胞的比值为100万/m L:200万/m L时可以在体外形成血管样结构。结论外周血中可以提取出特定细胞并在体外共培养形成血管样组织。

骨粘连蛋白促骨髓来源间充质干细胞成骨分化在青少年特发性脊柱侧凸中的作用

目的探究骨骼肌分泌的骨粘连蛋白(Osteonectin)促骨髓来源间充质干细胞(BMSC)成骨分化在青少年特发性脊柱侧凸(AIS)中的作用。方法纳入30例AIS患者,根据X射线片测量的Cobb角,将其分为轻度AIS组和重度AIS组。比较2组患者腰椎和骨骼肌骨密度(BMD)。收集2组患者BMSC,通过流式细胞术检测CD73和CD90蛋白表达,qRT-PCR检测Runx2、Osterix和Osteocalcin mRNAs表达水平,ELISA检测碱性磷酸酶(ALP)活性。收集2组患者骨骼肌,检测Osteonectin mRNA和蛋白表达水平。ELISA检测2组患者血清中Osteonectin水平。体外培养BMSC,分为BMSC组(无特殊处理)和BMSC+Osteonectin组(添加Osteonectin),检测Runx2、Osterix和Osteocalcin mRNAs表达水平及ALP活性。结果与轻度AIS组比较,重度AIS组患者腰椎和骨骼肌BMD降低(P<0.05),BMSC中Runx2、Osterix和Osteocalcin mRNAs表达水平降低(P<0.05),ALP活性降低(P<0.05);骨骼肌中Osteonectin mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.05);血清中Osteonectin水平降低(P<0.05)。与BMSC组比较,BMSC+Osteonectin组细胞Runx2、Osterix和Osteocalcin mRNAs表达水平升高(P<0.05),ALP活性升高(P<0.05)。结论AIS患者骨骼肌分泌Osteonectin减少,BMSC的成骨分化能力降低。外源性补充Osteonectin可改善BMSC的成骨分化能力,可能有助于AIS病情的恢复。

Osteonectin促进骨髓来源间充质干细胞成骨分化的机制及其与青少年特发性脊柱侧凸的相关性研究

目的 探究Osteonectin在促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的分子机制,以及Osteonectin在青少年特发性脊柱侧凸(AIS)中的作用。方法 将2020年5月—2022年5月就诊的20例AIS及健康体检20例分别作为AIS组和健康组。使用qRT-PCR技术测定2组BMSCs中Osteonectin、BMP2以及Wnt/β-catenin信号通路相关基因(Tcf7、Lef1)和成骨分化相关基因(Runx2、Osteocalcin)的表达水平。通过X线检测AIS患者的Cobb角度,并分析上述基因表达水平与Cobb角度的相关性。在BMSCs中,加入Osteonectin和BMP2抑制剂Noggin,并分为对照组、Osteonectin组和Osteonectin+Noggin组。通过qRT-PCR检测BMSCs中BMP2、Tcf7、Lef1、Runx2和Osteocalcin mRNA表达水平。采用ChIP-qPCR检测β-catenin在Runx2和Osteocalcin基因转录起始位(TSS)的富集水平。结果 与健康组比较,AIS组BMSCs中Osteonectin、BMP2、Tcf7、Lef1、Runx2和Osteocalcin mRNA表达水平均降低(P<0.05);Osteonectin、BMP2、Tcf7、Lef1、Runx2和Osteocalcin mRNA表达水平与AIS患者Cobb角度呈负相关(r=-0.466 3、-0.369 1、-0.272 7、-0.543 4、-0.606 5、-0.343 3,P<0.05,P<0.01)。与对照组比较,Osteonectin组BMSCs中BMP2、Tcf7、Lef1、Runx2和Osteocalcin mRNA表达水平升高,且β-catenin在Runx2和Osteocalcin mRNA TSS富集水平增加(P<0.05)。相比Osteonectin组,Osteonectin+Noggin组BMSCs中Tcf7、Lef1、Runx2和Osteocalcin mRNA表达水平降低,β-catenin在Runx2和Osteocalcin mRNA TSS富集水平降低(P<0.05)。结论 在AIS患者中,BMSCs中Osteonectin、BMP2-Wnt/β-catenin的表达以及成骨分化水平与AIS疾病的发展呈负相关。Osteonectin通过激活BMP2-Wnt/β-catenin信号通路,促使β-catenin转录激活成骨分化相关基因,从而促进BMSCs的成骨分化。

不同年龄小鼠骨来源间充质干细胞衰老相关特性与成骨分化能力的比较研究

目的探索不同年龄组小鼠骨来源的间充质干细胞(bone derived mesenchymal stem cells,BMSCs)衰老相关的生物学特性及骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)诱导成骨分化能力的改变。方法将8只C57BL/6J小鼠分为青年组(4周龄,体质量约为10~15 g,n=4)和老年组(12月龄,体质量约为20 g~25 g,n=4),每组雌雄各半。分别从2组小鼠的整骨中提取间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),通过流式细胞术鉴定2组BMSCs的表面标志物,通过β-半乳糖苷酶染色比较2组BMSCs的衰老程度,通过MTT和EdU掺入实验比较2组BMSCs的增殖及自我更新能力。通过Western blot分析2组BMSCs中周期蛋白CyclinD1、P21的表达情况。采用ALP染色和茜素红S染色及RT-qPCR评估2组BMSCs的体外成骨分化能力,使用RNA-seq分析比较2组BMSCs经BMP2诱导后的差异基因表达,并用流式分析验证测序结果。结果流式细胞术分析结果显示,分离培养的小鼠BMSCs符合间充质干细胞判定标准。β-半乳糖苷酶染色结果显示,老年组BMSCs的衰老水平显著高于青年组(P<0.05)。而MTT和EdU掺入实验结果表明,老年组BMSCs的细胞活力和增殖能力显著低于青年组(P<0.05)。Western blot结果显示,与青年组比较,老年组BMSCs的细胞周期蛋白CyclinD1表达水平较低,而细胞周期阻抑因子P21蛋白表达水平显著增高(P<0.05)。ALP染色和茜素红S染色及RT-qPCR检测结果显示,BMP2诱导后青年组BMSCs的成骨分化能力显著高于老年组(P<0.05)。RNA-seq结果显示,BMP2诱导后,整合素αV重组蛋白(cluster of differentiation 51,CD51)在青年组和老年组中的表达趋势相反。而流式细胞术分析结果显示,青年组CD51^(+)细胞在CD45^(-)细胞中占比明显高于老年组(P<0.01)。结论老年组BMSCs中CD51^(+)细胞在CD45^(-)细胞中占比下降与CD51^(+)细胞对BMP2的成骨诱导响应性下降密切相关。

外周血来源的间充质干细胞在脱矿松质骨支架中的增殖和成软骨能力的实验研究

目的:研究外周血来源的间充质干细胞(PBMSCs)在3D多孔支架中的生物学行为。方法:将兔PBMSCs接种到猪脱矿松质骨(DCB)支架中,并以骨髓间充质干细胞(BMMSCs)以及关节软骨细胞(ACCs)进行对照,通过扫描电镜观察3D环境中的细胞形态和分布;通过Live/Dead染色检测细胞活性,Hoechst33258法检测DNA含量,二甲基亚甲基蓝(DMMB)法检测糖胺聚糖(GAG)含量,酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫荧光法检测二型胶原(COL 2)表达、RT-PCR法定量分析软骨分化相关基因的表达。结果:扫描电镜(SEM)观察显示3种细胞在支架中均匀贴附,Live/Dead染色显示接种3天后3种细胞存活率相似(P>0.05),7天后3种细胞增殖能力以及DNA含量无明显差异(P>0.05)。PBMSCs和BMMSCs均较ACCs分泌更多GAG,但COL 2分泌量相似。此外,PBMSCs和BMMSCs的聚集蛋白聚糖(AGC),COL 2和碱性磷酸酶(ALP)等基因表达均明显上调(P<0.05);而ACCs组这些基因的表达显著下调(P<0.05)。MSCs组的COL 1表达趋于增加,而ACCs组中的表达趋于减少(P>0.05)。在成软骨诱导21天时,PBMSCs和BMMSCs的COL 2和ALP表达较ACCs升高(P<0.05),AGC和COL 1表达与ACCs相比无显著差异(P>0.05)。结论:外周血来源的间充质干细胞在异种脱矿松质骨支架中具有与骨髓间充质干细胞相似的良好的增殖和成软骨能力,但体外培养条件下依然存在肥大软骨细胞基因表达的现象,需要对培养条件进一步优化。

TGF-β信号通路对牙源性黏液瘤来源的间充质干细胞成骨分化的影响分析

目的探究转化生长因子-β(TGF-β)信号通路对牙源性黏液瘤(OM)来源的间充质干细胞(OMMSC)成骨分化的影响。方法选择2018年至2020年南京大学医学院附属口腔医院收治的OM患者2例,经手术取部分病灶标本进行OMMSC分离培养。另外选择于该院接受牙种植治疗的年轻患者5例,抽取颌骨骨髓进行颌骨骨髓来源的间充质干细胞(JBMSC)分离培养。通过细胞增殖实验、流式细胞术检测、茜素红S染色进行细胞鉴定。成骨培养7 d后通过实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测TGF-β信号通路以及成骨相关基因的表达情况。观察小分子药物SB431542及TGF-β1干预对OMMSC、JBMSC成骨分化能力的影响。结果经分离获得的OMMSC、JBMSC具有梭形形态,表达间充质干细胞表面标志物,并具有成骨分化能力,符合间充质干细胞的特征。与JBMSC相比,OMMSC具有更强的增殖能力。RT-PCR检测结果显示,TGF-β/Smad信号相关因子在OMMSC中呈高表达(P<0.05),成骨相关因子骨桥蛋白(OPN)表达降低(P<0.05)。茜素红S染色结果显示SB431542可显著促进OMMSC成骨分化,而TGF-β1对OMMSC成骨分化有抑制作用。结论该研究成功对OMMSC进行了分离,发现TGF-β信号相关因子在OMMSC中呈高表达,抑制TGF-β信号转导通路可增强OMMSC的成骨能力,为改善OM患者骨缺陷提供参考。

寻常型银屑病患者脂肪间充质干细胞对外周血淋巴细胞的免疫调控作用

目的观察寻常型银屑病患者脂肪间充质干细胞(AMSCs)对患者外周血淋巴细胞亚群及淋巴细胞因子表达和分泌相关炎症因子水平的影响,以探讨患者AMSCs对外周血淋巴细胞的免疫调控作用。方法将3例患者的AMSCs与患者外周血淋巴细胞共培养,通过流式细胞术检测外周血调节性T细胞(Treg)和辅助性T细胞17 (Th17)比例,用实时荧光定量PCR和酶联免疫吸附实验检测患者外周血淋巴细胞表达和分泌抑炎及促炎因子情况。结果与外周血淋巴细胞单培养组[(1. 0±0. 1)%]比较,健康人AMSCs促进Treg细胞[(3. 2±0. 5)%]增殖,差异有统计学意义(P=0. 001),患者AMSCs有促进Treg细胞[(1. 3±0. 2)%]增殖的趋势,但差异无统计学意义(P=0. 485)。同时,实时荧光定量PCR显示患者AMSCs与外周血淋巴细胞共培养组中外周血淋巴细胞表达Treg细胞叉头转录因子3及转化生长因子-β(TGF-β) mRNA的能力和健康人AMSCs与外周血淋巴细胞共培养组比较下降(P=0. 00,P=0. 03),对外周血淋巴细胞白细胞介素(IL)-10 mRNA的表达有促进趋势,但差异无统计学意义(P=0. 09);酶联免疫吸附实验结果显示,和健康人AMSCs与外周血淋巴细胞共培养组中抑炎细胞因子IL-10 [(156. 9±41. 8) ng/μl]和TGF-β[(2774. 1±526. 4) ng/μl]比较,患者AMSCs与外周血淋巴细胞共培养组外周血淋巴细胞分泌抑炎细胞因子IL-10 [(90. 4±28. 8) ng/μl]和TGF-β[(1597. 9±55. 7) ng/μl]的能力具有下降趋势,但差异无统计学意义。与外周血淋巴细胞共培养后,患者AMSCs共培养组Th17细胞[(0. 8±0. 3)%]占总淋巴细胞的比例与外周血淋巴细胞单培养组中Th17细胞[(1. 1±0. 1)%]占总淋巴细胞的比例相比较具有下降趋势,但差异无统计学意义,且患者AMSCs共培养组Th17细胞比例与健康人AMSCs共培养组比较差异无统计学意义,另外,患者和健康人AMSCs可能抑制外周血淋巴细胞表达和分泌Th17转录因子维A酸相关孤独受体γt及促炎因子IL-17、IL-23的作用不明显,且两组细胞的抑制作用差异无统计学意义。结论与健康人相比,寻常型银屑病患者AMSCs调控外周血Treg淋巴细胞免疫抑炎功能的能力明显减弱,而对外周血Th17淋巴细胞的免疫促炎功能无影响。

外周血间充质干细胞移植心肌梗死兔新生血管及心功能的变化

背景:药物治疗和支架置入治疗尚不能修复心肌梗死后已坏死的心肌。目的:观察外周血间充质干细胞移植治疗对心肌梗死兔新生血管及心功能的影响。方法:随机抽签法将36只大白兔分为假手术组,间充质干细胞移植组和对照组,结扎兔冠状动脉左室支建立心肌梗死模型。结果与结论:移植后4周,流式细胞仪分析显示绝大部分间充质干细胞表达CD44,极少量细胞表达CD34和CD45。间充质干细胞移植组梗死心肌组织有移植的间充质干细胞存活,超声心动仪示间充质干细胞移植组左心室射血分数及短轴缩短率明显高于对照组(P<0.01);左心室收缩末内径和舒张末内径明显小于对照组(P<0.01)。间充质干细胞移植组心肌纤维化程度、心肌梗死面积均明显小于对照组(P<0.01)。免疫组织化学染色显示间充质干细胞移植组新生毛细血管密度明显高于对照组(P<0.01)。提示外周血间充质干细胞移植增加了梗死心肌新生血管密度,改善心脏的功能。

兔外周血间充质干细胞的体外分离培养及诱导成骨

背景:研究证明外周血中存在间充质干细胞,但含量极少。目的:拟从兔外周血中提取间充质干细胞,并诱导其向成骨细胞分化。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-06/12在山东省立医院中心实验室完成。材料:新西兰大白兔6只,购自山东省农科院。α-MEM培养基、L-DMEM培养基为Hyclone公司产品。方法:每隔2d从兔背部不同部位切去3cm×3cm的全层皮肤(保留背部肌层),所切皮肤做原位移植后包扎,每只兔连续创伤4次。分别于创伤前及末次创伤1周后从股静脉取外周血,采用密度梯度离心法获取间充质干细胞,设立2组,分别加入含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基或L-DMEM培养基。细胞传至第2代以1×105/cm2密度接种于12孔板,加入含成骨诱导剂的H-DMEM培养液进行成骨诱导。主要观察指标:创伤前后细胞形态观察,成纤维样细胞集落形成率,成骨诱导效果。结果:创伤前所获得的细胞首次换液后,未见有梭形细胞贴壁;创伤后所获得的细胞接种24h即可见有短梭形及多角形细胞贴壁,五六天后出现细胞集落。与L-DMEM培养基组比较,α-MEM培养基组外周血成纤维样细胞集落形成率明显升高(P<0.05)。外周血间充质干细胞成骨诱导后,呈梭形、三角形或多角形,有突起,可见两三个核仁和细胞分裂相,增殖速度缓慢,诱导7d后碱性磷酸酶阳性率达80%以上,诱导21d后茜素红染色形成钙结节。结论:皮肤损伤刺激后可成功从兔外周血中获取间充质干细胞,且具备成骨分化特性,α-MEM培养基较L-DMEM培养基更适合外周血间充质干细胞的体外生长。

外周血间充质干细胞复合富血小板血浆对腱骨界面愈合的影响

探讨兔外周血间充质干细胞(PB-MSCs)复合富血小板血浆(PRP)对腱骨愈合的作用效果。48只新西兰兔分成4组,行前交叉韧带重建术,分别向各组股骨道内注入凝胶、PRP凝胶、PB-MSCs凝胶及PRP+PB-MSCs凝胶。术后4、8、12周各组随机处死4只实验兔,对标本行HE染色,观察腱骨界面组织形态学特点。与对照组相比,PRP组、PB-MSCs组及PRP+PB-MSCs组3个时间点组织形态学评分更高,其中PRP+PB-MSCs组评分最高,差异有统计学意义(P<0.01)。说明PRP、PB-MSCs均能促进腱骨愈合,并且PBMSCs与PRP具有协同作用。

人脐血间充质干细胞培养及对异体外周血T淋巴细胞增殖的影响

目的:研究发现间充质干细胞具有独特的免疫调节特性,体外能够抑制混合淋巴细胞培养或有丝分裂原刺激中的T淋巴细胞增殖。实验观察体外分离培养的脐血间充质干细胞对异体外周血T淋巴细胞增殖的抑制效果。方法:实验于2004-10/2006-06在解放军兰州军区兰州总医院完成。①对象:足月正常分娩产妇脐血及健康志愿者外周血分别由解放军兰州军区兰州总医院妇产科、血液科提供,产妇与志愿者对实验均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准。②实验方法:Percoll法分离脐血单个核细胞,贴壁纯化,达80%～90%融合时胰蛋白酶消化,按2.0×108L-1密度传代,取第4～5代细胞用于实验。密度梯度法分离外周血单个核细胞,以含体积分数为0.2胎牛血清的RPMI 1640培养基调整细胞浓度至1×109L-1时加入尼龙棉柱内,用培养基冲出非黏附细胞即为T淋巴细胞。脐血间充质干细胞分为2×108,1×108,0.5×108L-1组,各100μL接种于96孔培养板,加入2×108L-1T淋巴细胞悬液100μL,再给予植物血凝素刺激T淋巴细胞转化。以T淋巴细胞+植物血凝素为阳性对照。③实验评估:观察体外培养的脐血间充质干细胞形态,应用流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达。MTT法测定脐血间充质干细胞对异体外周血T淋巴细胞增殖的影响。结果:①形态特征与表面抗原表达:原代培养10～18d形成平行排列、辐射状或旋涡状的成纤维样细胞,即为脐血源性的间充质干细胞,传代7d左右细胞达90%融合。流式细胞仪检测90%细胞稳定表达间充质干细胞相关抗原CD13,CD29,CD44,CD166,不表达造血细胞系的表面抗原CD34,CD45。②脐血间充质干细胞对异体T淋巴细胞增殖的抑制:与阳性对照比较,经脐血间充质干细胞共培养后植物血凝素刺激T淋巴细胞的增殖作用受到抑制,增殖指数明显降低(P<0.01)。间充质干细胞与T淋巴细胞比值为1:1,1:2和1:4时的增殖抑制率分别为(48.16±2.31)%,(34.47±3.09)%,(22.15±2.63)%。结论:脐血间充质干细胞可显著抑制异体外周血T淋巴细胞的增殖,该抑制作用呈剂量依赖性。

间充质干细胞来源的外泌体治疗器官纤维化的研究进展

器官纤维化是组织损伤后过度修复的结果,与器官衰竭和高死亡率有关,因而寻找有效的治疗纤维化的方法具有重要价值。近年来研究发现间充质干细胞来源的外泌体具有体积小、免疫原性低、无致瘤作用等优势,在抗纤维化方面显示出良好的应用前景。该文综述了间充质干细胞来源的外泌体治疗各种器官纤维化的机制及相关研究进展。

间充质干细胞体外扩增联合自体外周血造血干细胞移植治疗恶性血液病

目的 探讨体外培养扩增临床规模的人骨髓间充质干细胞(MSCs)的可行性及其联合自体造血干细胞(APBSCs)移植治疗恶性血液病的可行性、安全性和对造血重建的影响。方法 骨髓单个核细胞(MNC)来自12例正常人及恶性血液病患者,采用无血清培养基体外培养人骨髓间充质干细胞(MSCs)。MSCs联合APBSCs移植治疗4例恶性血液病。结果 能够从所有2 6 .3±8.8ml骨髓样本中提取MSCs,其中10例成功扩增。4例患者接受扩增后MSCs联合APBSCs输注。MSCs输注无明显不良反应。中性粒细胞≥0 .5×10 9/L和血小板≥2 0×10 9/L中位时间分别为9(8～11)d和8.3(7～10 )d。结论 应用无血清培养体系可培养扩增临床规模的人MSCs。MSCs联合APBSCs共移植安全可行。快速的造血恢复提示在清髓性治疗后输注MSCs可促进造血。

脐血间充质干细胞抑制外周血淋巴细胞增殖的作用

目的研究脐血间充质干细胞(UCBMSC)对成人外周血淋巴细胞增殖的影响。方法分离、扩增UCBMSC并鉴定其表面标志及向成骨细胞及脂肪细胞的分化能力。UCBMSC与淋巴细胞直接共培养并用植物血凝素(PHA)刺激,或在TranswellTM非接触体系中,用PHA刺激共培养。两个培养体系均分为阴性对照组(淋巴细胞单独培养组)、阳性对照组(淋巴细胞加PHA刺激组)、实验组(淋巴细胞加PHA和UCBMSC组)。四氮唑衍生物MTS还原法测定细胞增殖并计算抑制率。结果在共培养与TranswellTM非接触体系中不同数量UCBMSC对淋巴细胞增殖均具有抑制作用,且UCBMSC浓度越高,抑制作用越强(P<0.05),具有剂量依赖性。但两体系中UCBMSC与淋巴细胞比值相同时,共培养体系抑制作用较非接触体系强,且差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 UCBMSC能抑制淋巴细胞增殖,且共培养体系抑制作用较非接触体系强。