荧光定量PCR和外周血白细胞pp65抗原血症实验对肾移植术后巨细胞病毒感染的检测

目的 探讨肾移植术后 3个月巨细胞病毒 (CMV)的感染状况 ,比较荧光定量PCR和外周血白细胞 pp6 5抗原血症实验两种方法对肾移植术后巨细胞病毒感染的检测情况和使用价值。方法 分别用荧光定量PCR、外周血白细胞 pp6 5抗原血症实验和ELISA法对我院 2 0 0 1年 1月～2 0 0 2年 12月 5 6例肾移植患肾移植术后 3个月的外周血进行巨细胞病毒的检测。结果 5 6例肾移植患者中CMVpp5 6抗原血症阳性 9例 ( 16 1% ) ,PCR阳性 11例 ( 19 6 % ) ,12例 ( 2 1 4 % )诊断为CMV感染 ,其中 7例为症状性感染 ,5例为无症状性感染。荧光定量PCR和外周血白细胞 pp6 5抗原血症实验的一致性为 92 % ,阳性符合率 6 7% ,阴性符合率 92 %。CMVpp6 5抗原、CMVDNAPCR、CMV IgM的敏感性、特异性分别为 72 %、92 % ;10 0 %、92 % ;4 3%、88%。结论 荧光定量PCR和外周血白细胞 pp6 5抗原血症实验的联合应用 ,对监测CMV活动性感染、临床疗效及预后更加客观。

外周血白细胞中人巨细胞病毒pp65抗原的定位及意义

目的明确人巨细胞病毒(HCMV)磷酸基质蛋白65(pp65)抗原在阳性细胞中的定位并初探其定位与病毒活动间的关系,为指导临床病毒抗原血症的监测提供依据。方法利用4,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)荧光染料能与细胞双链DNA结合的特点,在激光共聚焦显微镜下对HCMV pp65单抗阳染细胞进行抗原定位;同时通过外周血白细胞与病毒共培养技术,检测分析其定位与病毒活动的关系。结果临床标本检测的HCM- Vpp65抗原阳染细胞的表现形式有3种,即细胞浆型、细胞核型和细胞浆核混合型,其中细胞核中的HCMV pp65抗原聚集于细胞核的内部,而非仅仅附着于核表面。进一步的白细胞与病毒共培养结果显示,只有野生型病毒株感染的人胚肺成纤维细胞(HELF)与外周血白细胞共培养,才能检出HCMV pp65抗原阳性的白细胞,而且表现为仅初期(培养1 h内)可检出细胞浆阳染型,随着时间延长,约80%～90%的抗原阳染白细胞表现为细胞核型,偶见细胞浆核混合型。结论HCMV pp65抗原血症时阳染的外周血白细胞的表现形式有3种,即细胞核型、细胞浆型以及细胞浆核混合型,其中细胞核型属细胞核内部型,并非细胞核表面附着型。结合共培养结果认为,细胞核型阳染细胞的检出更能提示病毒的活动。

人巨细胞病毒pp65抗原血症检测方法的建立和初步临床应用

目的 建立人巨细胞病毒抗原 pp6 5 (HCMVpp6 5 )血症特异、灵敏和低成本的酶免组化和荧光免疫组化方法 ,以利于临床推广应用。方法 以HCMV AD16 9感染的人胚肺成纤维细胞 (HELF)爬片作阳性对照 ,选择试剂和材料组建试剂盒 ,并与商品化的同类试剂盒作比较 ,建立人外周血多形核白细胞 (PMNLs)中HCMVpp6 5抗原阳性细胞的检测方法 ,然后再用荧光定量PCR(FQ PCR)方法做相应考评。 结果 我们建立的HCMVpp6 5抗原血症检测法能成功地检出PMNLs中的 pp6 5阳性细胞。其可检测限分别为 10 2 pfu/ml的AD16 9攻击 2 4h后的HELF细胞爬片和 3～ 5个 pp6 5阳性细胞 / 2× 10 5PMNLs ;用高相对分子质量 (5 0 0 0 0 0 )的葡聚糖能快速、有效地分离PMNLs ;用 4 %中性多聚甲醛固定的细胞片 ,于 - 2 0°C或以下可长期保存 (≥ 6个月 ) ,而且 pp6 5抗原性稳定。 结论 自建的试剂盒与同类进口试剂盒相比 ,检测 pp6 5的结果差异无显著性 ,并与FQ PCR的检测结果相一致 ,其检测特异、灵敏、操作简单、费用低廉 ,适宜临床实验室推广应用。

实时定量聚合酶链反应在肾移植后人巨细胞病毒活动性感染的临床应用研究

目的:建立血浆、外周血白细胞HCMV DNA实时定量聚合酶链反应检测方法,评价其监测肾移植后人巨细胞病毒活动性感染的临床应用价值。方法:用重组质粒PQHY-1制作标准曲线;分别用实时定量聚合酶链反应和免疫组织化学方法,对28例肾移植术后病人采血标本动态检测,并将结果进行比较。结果:实时定量PCR最低可检测出20拷贝/孔的HCMV DNA,且可重复性强(批内及批间误差均<5％),在102～107拷贝/孔的浓度范围时与Q值有很好的线性关系(r=-0.978)。与PP65抗原血症检测结果比较,血浆及外周血白细胞定时定量检测的灵敏度分别为88.5％,94.2％;特异度分别为97.8％,95.4％。HCMV活动性感染时血浆和外周血白细胞HCMV DNA平均含量分别为102.4拷ml和103.2拷贝/106PBL。血浆和外周血白细胞中HCMV DNA阳性检出时间较PP65抗原血症阳性检出时间平均要早1.6和3.8天。结论:实时定量聚合酶链反应检测方法是一种灵敏度高,特异度好的定量检测方法,可用于监测早期HCMV活动性感染。