外周血MDR1荧光定量检测与肝癌近期转移复发的相关性分析

目的 探讨原发性肝癌病人癌组织和外周血白细胞 (PBL)中多药耐药基因 (MDR1 )的表达及其相关性 ,分析其与预后的相互关系 ,寻求建立临床上简便易行的化疗方案及预后评估指标。方法 应用荧光定量—聚合酶链反应 (FQ PCR)技术和免疫组织化学方法 ,分别检测 5 0例肝癌病人及 1 5例对照组病人的外周血和肝癌组织中MDR1的表达。结果 以免疫组织化学和荧光定量PCR方法测定肝癌组织MDR1阳性表达率分别为 70 %和 6 6 % ,荧光定量PCR方法测定外周血白细胞MDR1阳性表达率为 5 2 % ,统计学分析无显著性差异。外周血MDR1表达阳性病人近期复发率为34.6 % ,表达阴性者为 1 2 .5 % ,统计学上存在显著性差异。结论 肝癌组织和外周血白细胞MDR1表达具有相关性 ,外周血MDR1表达荧光定量检测结果可作为指导化疗和评估预后的动态监测指标。

SYBR荧光实时定量PCR检测非小细胞肺癌组织与外周血中RRM1和ERCC1及BRCA1基因表达水平

目的:建立荧光实时定量PCR技术,检测非小细胞肺癌组织与外周血RRM1和ERCC1及BRCA1基因表达水平。方法:分别构建RRM1、ERCC1和BRCA1及管家基因β-actin质粒标准品,以SYBR荧光实时定量PCR分析,制备标准曲线,对非小细胞肺癌组织与外周血中RRM1、ERCC1和BRCA1及管家基因β-actin的mRNA进行检测。结果:标准曲线呈良好的线性关系。标准品的熔解曲线均呈单峰,特异性良好,说明基本无非特异性扩增。结论:所建SYBR荧光实时定量PCR方法操作简便,费用低,特异性好,准确度、灵敏度高,为后续研究构建了理想的平台。

荧光定量RT-PCR检测肺癌外周血CK19mRNA表达

目的 应用荧光定量RT-PCR(Fluorogenic quantitative reverse transcriptase polymerasechain reaction,RT-PCR)检测肺癌外周血中微转移情况。方法 用荧光定量RT-PCR方法检测57例肺癌患者外周血CK19mRNA表达。结果 57例肺癌患者外周血中CK19mRNA检测阳性19例,阳性率33.3％,统计结果显示外周血CK19mRNA的表达与性别、年龄、病理类别无关,在不同分化程度、淋巴结转移状态、临床分期间有显著差异。结论 以CK19mRNA为分子标记,用荧光定量RT-PCR法检测肺癌患者外周血微转移具有很高的灵敏度,有助于亚临床转移的早期发现。

新型Taq Man-MGB探针实时荧光定量PCR检测人类mdr1基因

目的建立一种比现有方法敏感、准确性高、重复性好的人类mdr1基因的新型实时荧光定量PCR检测新方法。方法用Primer Express 2．0引物设计软件设计引物和MGB探针,以Taq Man-MGB探针技术为基础,运用Taq Man-MGB探针,以含有目的基因mdr1cDNA的质粒pHaMDR1／A为阳性模板,建立实时荧光定量PCR检测方法。结果所建立方法的最低检测限度为15个基因拷贝／反应,在待扩增DNA浓度为3．061×103 cps／ml-3．061×109cps／ml范围时,模板浓度与循环阈值(Ct)之间的相关性良好,决定系数r2为0．988243。结论应用Taq Man-MGB探针的实时荧光定量PCR方法检测人类mdr1基因,具有灵敏度高、特异性高和精确性高等优点。

荧光定量RT-PCR检测mdr-1基因表达

目的 :建立荧光定量RT PCR检测肿瘤细胞mdr 1基因表达的方法 ,了解肺癌组织中mdr 1的表达水平。方法 :建立荧光定量RT PCR方法 ,在PE770 0型检测仪上定量检测K5 6 2 /ADM耐药株和K5 6 2不耐药株细胞mdr 1基因表达水平 ,同时检测 45例初治肺部肿瘤病人组织标本。结果 :荧光定量RT PCR检测K5 6 2 /ADM耐药株和K5 6 2不耐药株细胞mdr 1基因表达 ,重复 10次实验所得结果平均分别为 (6 86± 0 6 5 )× 10 7拷贝 /μgRNA和 (8 49± 0 6 7)× 10 5拷贝 /μgRNA ,两者相差 80 8倍 ,变异系数分别为 9 5 %和 7 9%。 45例肺部肿瘤中 ,有 12例检出有mdr 1基因不同程度的表达。结论 :荧光定量RT PCR检测mdr 1基因表达方法 ,检测结果用绝对拷贝数来表示 ,定量准确可靠 ,并有利于标准的统一。有 1/4未经化疗的肺癌病人有一定水平mdr

三疣梭子蟹十足目虹彩病毒1 SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

为建立十足目虹彩病毒1(decapod iridescent virus 1,DIV1)的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,根据DIV1的MCP和ATPase基因序列,设计并筛选出引物,以制备的DIV1阳性质粒标准品为模板构建标准曲线,建立DIV1的SYBR Green I qPCR方法,并对该方法进行临床初步应用。结果显示,建立的qPCR方法阈值循环数(cycle threshold value,Ct)与标准品拷贝数的对数线性关系良好,标准曲线相关系数(R^(2))为0.999;对DIV1阳性的虾蟹核酸样本能够进行特异性扩增,但对传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)和白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)阳性核酸样本均无扩增;最低检测限为9.77 copies/μL;Ct值的组内和组间变异系数均小于1%。运用该方法对70份疑似感染DIV1的虾蟹类样本进行DIV1检测,该方法阳性率为48.57%,与套式PCR检测方法的阳性率一致;利用建立的方法对DIV1阳性三疣梭子蟹的血淋巴、肝胰腺及心脏等组织进行定量检测分析,结果显示各组织中均存在DIV1,其中血淋巴中DIV1平均拷贝数最高。研究表明,建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于对DIV1的快速、定量检测,对十足目虹彩病毒病的诊断和防控具有重要意义。

生理状态下外周血白细胞IL-2基因表达的荧光定量PCR检测

目的:建立白细胞介素2(IL-2)基因表达的绝对定量实时PCR检测技术。方法:应用实时定量PCR方法检测25名健康运动员中IL-2mRNA的表达。主要结果和结论:应用实时定量PCR方法能够对健康受试者外周血白细胞自发性IL-2mRNA表达进行定量分析,相关系数r>0.99。

荧光定量RT-PCR检测mdr_1在急性白血病中的表达及临床意义

采用荧光定量 RT- PCR法检测 36例不同类型白血病患者的多药耐药基因 (mdr1 m RNA)表达 ,同时检测 15例骨髓或外周血正常患者 ,以做对照。结果对照组均为阴性表达 ,初治患者组 m dr1 阳性基因拷贝数平均为 2 .7× 10 3拷贝 / μg RNA;复发难治患者组为 1.0× 10 4拷贝 / μg RNA(P<0 .0 5 )。表达阴性 m dr1 与 mdr1 阳性患者的完全缓解 (CR)率分别为 82 %和 2 1% (P<0 .0 5 )。提示荧光定量 RT- PCR检测 mdr1 基因表达结果用绝对拷贝数表示 ,其定量准确、可靠。临床急性白血病化疗耐药的发生主要与 mdr1 阳性高表达有关。

实时荧光定量PCR检测急性髓细胞白血病患者MDR1基因表达及临床意义

目的定量分析急性髓细胞白血病(AML)患者MDR1基因的表达水平及其与临床特征及疗效的关系。方法构建实时荧光定量PCR检测MDR1基因表达的技术,并定量检测43例AML患者MDR1基因的表达水平及分析其与血象、免疫分型及临床疗效的关系。结果建立的实时荧光定量PCR方法的标准曲线相关系数>0.99。AML患者MDR 1基因表达水平较正常对照组显著升高(P<0.001),FAB分型中M2,M5型患者MDR1基因表达水平显著高于M3型患者(P<0.05及P<0.025)。MDR 1基因的表达量与AML发病时外周血白细胞计数、血红蛋白、血小板无相关关系;而伴有CD34表达阳性AML患者MDR1基因表达水平显著高于阴性患者(P<0.01);MDR 1基因高表达的初治AML患者诱导化疗的CR率显著低于低表达病例(P<0.01)。结论实时荧光定量PCR技术检测急性白血病患者MDR 1基因表达量可更准确判断AML患者的预后及早期预测难治和复发。

利用时间分辨荧光免疫层析法同时定量检测玉米中的伏马毒素B_(1)、B_(2)和B_(3)

建立了一种可同时定量检测玉米中伏马毒素B_(1)、B_(2)和B_(3)的时间分辨荧光免疫层析方法。利用活化酯法制备时间分辨荧光微球和伏马毒素抗体的偶联物,将伏马毒素抗原包被到硝酸纤维素膜上作为T线,通过优化不同T线包被条数,最终建立伏马毒素竞争性免疫层析方法。并对所建立方法的灵敏度、特异性、准确度、精密度和与国标方法分析结果的相关性进行评价。包被两条T线建立的检测方法检出限为107.68~168.28μg/kg,定量限为283.46~444.63μg/kg;与伏马毒素B_(1)、伏马毒素B_(2)和伏马毒素B_(3)的交叉反应率分别为100%、85.59%和72.72%,与其它5种常见的真菌毒素均无明显交叉;加标回收率范围88.37%~117.42%,变异系数小于10%;该方法与国标方法GB 5009.240-2016中规定的免疫亲和柱净化-高效液相色谱法(IAC-HPLC)检测结果的符合度在92.17%~107.21%之间。建立的时间分辨荧光免疫层析检测方法能满足对玉米中伏马毒素B_(1)、B_(2)和B_(3)的现场快速定量检测。

SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测类猪圆环病毒因子P1

该研究旨在建立快速、敏感和特异的检测类猪圆环病毒因子P1的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR法,用于P1的早期诊断。以感染P1的猪血清DNA提取物为模板,采用PCR扩增P1 101 bp的基因片段,将其克隆至pMD18-T载体,重组质粒测序并进行同源性分析;以阳性质粒为模板,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法,并进行敏感性和特异性检测。经测序证实扩增片段属于P1,所建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测P1的反应在101-108拷贝/μL之间具有良好的线性关系,反应的检出下限为10拷贝/μL,而对猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等的检测为阴性,表明该方法敏感、特异。成功建立了SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测P1载量的方法,为P1致病机制和机体免疫保护机制的研究提供了技术平台。

超级细菌bla_(NDM-1)基因TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立

为建立快速检测超级细菌编码新德里金属β-内酰胺酶1(NDM-1)的bla_(NDM-1)基因的方法,本研究针根据bla_(NDM-1)及其变异体的基因序列设计一对特异性引物和一条MGB探针,以构建的含有bla_(NDM-1)基因片段的重组质粒作为阳性标准品,经条件优化,建立了检测bla_(NDM-1)基因的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。结果显示该方法可以特异性扩增bla_(NDM-1)基因重组质粒标准品,而对鸡白痢沙门氏菌、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的标准菌株扩增均为阴性;检出下限为2.59拷贝/μL,比常规PCR敏感性高100倍;组内及组间重复性试验的变异系数均小于1.5%。利用所建立的方法对34株鸡源致病性沙门氏菌分离株进行检测,结果均未检测到目的片段,表明所有分离株均未携带bla_(NDM-1)基因。本研究建立的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于监测携带bla_(NDM-1)基因及其变异体的超级细菌。

以主要流行EV71 VP1基因高度保守区为靶点的TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

在我国,肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)C4型是引起手足口病的主要流行基因型。为建立EV71C4型TaqMan荧光定量PCR检测方法,在C4型EV71VP1基因的高保守区,设计合成引物和TaqMan探针,将包含此目的区段的基因片段克隆到pcDNA3.1载体中,通过体外转录获得标准品,并以梯度稀释的标准品为模板建立工作曲线,进而在优化反应条件的基础上建立TaqMan荧光实时定量PCR检测方法。实验中,所设计引物、探针的高度保守性保证了C4型EV71的高效扩增。经反应条件优化,引物和探针的最佳工作浓度分别为300 nmol/L和200 nmol/L,在1×10~301×10~3拷贝数检测范围内具有良好的线性关系(R^2=1),灵敏度可达到10~2 copies/μL。通过对该方法进行检验发现,批间和组间重复实验的变异系数均小于0.5%,且该方法对柯萨奇A16(coxsackievirus A16,CA16)柯萨奇B1(coxsackievirus B1,CB1)人轮状病毒(human rotavirus,HRV)单纯疱疹病毒2型(herpes Simplex virus type 2,HSV-2)均无交叉反应,对6份EV71阳性样本检出率为100%。以上数据表明,文中建立的TaqMan荧光定量PCR方法可为我国主要流行C4型EV71感染的快速诊断及疾病监控提供有效途径。

H5N1虎源流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及临床应用

根据本室分离获得的虎源H5N1流感病毒的HA基因序列测定结果。结合GenBank中报道的H5亚型禽流感病毒HA基因序列进行同源性比较分析。选择保守序列区作为扩增区域，利用Primer5．0引物设计软件和BLAST软件程序设计出特异性扩增引物。采用成本较低、不需要特异探针引物、优化周期短。能区分病毒变异株的SYBR GreenⅠ随机掺入法建立定量PCR反应体系，并对反应条件进行优化。试验结果表明应用该方法对虎源H5流感病毒的检测具有高度的特异性，检测的灵敏度为10^1-10^2拷贝数。对20份病死老虎临床病料和24份人工感染的小鼠脏器病料用荧光定量RT-PCR方法、常规RT-PCR方法和病毒分离方法进行检测。荧光定量RT-PCR方法检测结果略高于常规RT-PCR方法，但与病毒分离方法结果相一致。这说明荧光定量RT—PCR方法可以对临床上H5N1虎源流感病毒检测提供参考。

菠萝凋萎相关病毒-1实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立与应用

菠萝凋萎相关病毒-1(Pineapple mealybug wilt associated virus-1,PMWaV-1)是田间检出率最高的菠萝凋萎病毒。本研究根据PMWaV-1CP基因保守序列设计特异性TaqMan探针和引物,建立并优化了PMWaV-1实时荧光定量RT-PCR检测方法。优化后的反应体系制备的标准曲线为y=-3.307×log x+38.18,相关系数r2为0.998。试验结果表明,该方法能特异性地检测PMWaV-1,对PMWaV-2、3和阴性对照均无反应;最低检测限达到40拷贝。重复性试验表明批内和批间变异系数均小于1.98%,是一种操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性较好的PMWaV-1定量检测方法。样品检测结果表明PMWaV-1在菠萝植株老叶、嫩叶和吸芽中的病毒含量呈递减趋势。

荧光定量PCR检测UCA1 mRNA方法学建立及临床评估

目的建立荧光定量体外检测 UCA1 mRNA 的实验方法。方法用已构建的 pcDNA3.1/UCA1 重组质粒作为标准品,建立实时荧光定量 PCR 检测尿液、血液标本 UCA1 mRNA 的方法,并进行方法学评价。应用此方法检测 24 例膀胱癌组、30 例泌尿系统非膀胱癌组(包括肾癌、前列腺癌)以及 20例健康对照组的尿液和血液中 UCA1 mRNA 的表达,并进行临床评估。结果膀胱癌患者血、尿标本的阳性符合率分别为 91.67% 和 87.50%,而泌尿系统非膀胱癌患者血、尿标本的阳性符合率为 63.33% 和66.67%,10 份消化系统肿瘤(肝癌、胃癌、食管癌、直肠癌)患者全血标本、10 份肺癌患者的全血标本、20 份健康人标本全血和尿液标本均为阴性。膀胱癌组阳性率高于其它系统肿瘤和健康对照组(P<0.01)。在膀胱癌组中,UCA1 mRNA 的表达与临床分期和病理分级有显著的相关性(P<0.05)。结论本研究成功建立了可用生物体液(如血液、尿液等)检测 UCA1 mRNA 的技术。