BMP-12重组腺病毒载体转染外周血MSCs向肌腱/韧带细胞分化研究

目的探讨携带BMP-12基因的腺病毒载体转染诱导外周血MSCs向肌腱/韧带细胞分化的效果。方法取3～4月龄新西兰兔外周血,体外分离培养外周血MSCs至第3代。采用Ad Easy腺病毒载体系统制备BMP-12重组腺病毒载体。将BMP-12重组腺病毒体体外转染第3代外周血MSCs,转染后24 h通过流式细胞术（flow cytometry,FCM）检测转染效率,倒置相差显微镜观察细胞形态变化,转染后8、24 h在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）表达;转染后0、7、14 d,采用免疫组织化学染色观察I型胶原表达情况;实时定量PCR检测肌腱/韧带特异基因Tenomodulin、Tenascin-C和Decorin m RNA表达水平,并设未转染细胞作为对照组。结果转染后24 h,倒置相差显微镜观察示细胞生长增殖缓慢,细胞形态清晰;FCM检测示,转染组转染效率为99.57%,未转染组为2.46%;转染后8 h,荧光显微镜下即可见GFP表达,随培养时间延长GFP表达逐渐增多,24 h时几乎所有细胞均可见GFP表达。免疫组织化学染色示,随转染时间延长,Ι型胶原表达逐渐增强;转染组转染后14 d,肌腱/韧带特异基因Tenomodulin、Tenascin-C和Decorin m RNA表达水平分别为0.061±0.013、0.029±0.008、0.679±0.067,均显著高于未转染组的0.004±0.002、0.003±0.001、0.142±0.024,差异有统计学意义（t=—7.700,P=0.031;t=—5.741,P=0.020;t=—12.998,P=0.000）。结论 BMP-12重组腺病毒载体可明显促进外周血MSCs向肌腱/韧带成纤维细胞表型分化,并促进肌腱/韧带特异基因表达和细胞外基质产生,为外周血MSCs用于肌腱/韧带再生提供了依据。

Sprague-Dawley大鼠外周血来源间充质干细胞的动员、分离培养及鉴定

目的：探讨Sprague—Dawley大鼠外周血来源间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）的动员、分离培养及鉴定方法，分析其表面标记和多向分化潜能，为运动创伤中的细胞治疗和组织工程产品培育提供新来源的、可以微创获得和自体细胞移植的种子细胞。方法：联合动员大鼠外周血MSC．采集腹主动脉外周血4ml。使用淋巴细胞分离液结合密度梯度离心方法分离外周血单核细胞，体外培养至第3代。于显微镜下观察其形态和生长状态。取第3代MSC，鉴定其表型并向成骨、成脂和成软骨诱导分化．以证明其干细胞的特性。结果：经淋巴分离液结合密度梯度离心方法分离培养的外周血单核细胞．3～5天可见少量长梭形细胞贴壁，7-9天见细胞成簇生长，并形成克隆集落。第3代细胞形态较均一．生长增殖良好；表达典型的MSC标记CD44和CD90，不表达造血干细胞标记CD34和CD45。成骨诱导21天后，茜素红和ALP染色阳性，有矿化结节形成。成脂诱导21天后，油红0染色阳性．细胞内有脂滴形成。细胞微团无血清成软骨诱导21天后。甲苯胺蓝染色阳性，细胞外有蛋白多糖分泌：免疫组织化学染色示，特异性软骨基质II型胶原表达阳性。结论：采用联合药物动员方法能促进干细胞向外周血释放，分离培养的外周血干细胞经鉴定为MSC，体外具备三系分化潜能，有望成为运动创伤中新的细胞治疗和组织工程产品培育的种子细胞来源。