中国热带农业科学院在植物病毒致病机理研究方面取得新进展

近日,中国热带农业科学院热带生物技术研究所/热带作物生物育种全国重点实验室阮孟斌团队在植物病毒致病机理研究方面取得新进展,揭示了芜菁皱缩病毒外壳蛋白(TCV CP)与mRNA降解途径关键因子核酸外切酶4(XRN4)相互作用抑制寄主mRNA降解功能,提高病毒致病性的新策略。

葡萄A病毒外壳蛋白基因克隆及分子变异分析

为获得葡萄A病毒（Grapevinevirus A，GVA）外壳蛋白（CP）基因，并为开展GVA-CP介导的抗病毒转基因研究提供基础，本研究从葡萄休眠枝条中扩增获得12个GVA分离物的CP基因序列，全长597nt，编码198个氨基酸。所得分离物间核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83．9％～99．8％和92．4％～99．5％，与GenBank中12个GVACP序列比较，核苷酸和氨基酸序列同源性分别为71．0％～93．1％和81．8％～98．0％。系统进化分析表明，本研究12个分离物CP序列与已报道的GVAI组亲缘关系最近。种群变异分析表明，GVA种群具有多种变异体类型，并且多个样品存在不同变异体类型的复合侵染。但绝大多数变异体克隆聚集在GVAⅠ组分支，有60％的克隆序列间同源性较高，并且聚集在同一个次级分支ⅠAa，表明其为该GVA种群的优势序列。克隆的GVACP基因以及优势序列群体的分析为葡萄抗病毒转基因研究奠定了基础。

海洋球石藻Emiliania huxleyi(Prymnesiophyceae)病毒主要外壳蛋白基因的克隆与序列分析

在实验室纯培养条件下,用过滤的海洋球石藻特异性病毒(Emiliania huxleyi virus,EhV)EhV-99B1株感染球石藻(E. huxleyi,Eh),建立病毒与宿主之间稳定的感染体系,病毒裂解滤液经卷式切向流超滤和PEG8000浓缩、CsCl密度梯度离心,获得足量高纯度的病毒颗粒。根据已报道的其它EhV株系主要外壳蛋白(MCP)基因内保守片段设计合成一对特异引物,从EhV-99B1病毒基因组中克隆到了长度约为300bp的病毒外壳蛋白基因保守片段。该片段与pBS-T载体连接后转化Escherichia coli DH5α,对筛选到的阳性克隆进行序列测定与分析。结果表明,该克隆片段与GenBank中EhV163(AF453851)分离株的同源性最高,该区域内的核苷酸与对应推导的氨基酸序列同源性均为100%,证实获得的DNA片段是EhV-99B1的外壳蛋白基因;与EhV203(AF453855)分离株的核苷酸及氨基酸序列的同源性较低,分别为93%和100%。表明该病毒在自然海域中分布广泛并具有一定的多态性,同时在进化上也存在相当的复杂性。因此,MCP基因可以作为一种新的分子遗传标记以区分自然群落中EhV的不同基因型,对于理解海洋球石藻类病毒与宿主之间复杂的相互作用关系将是一个十分有价值的工具。

番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因及抗菌肽D基因双抗表达载体的构建

选取分别被克隆到Ｃｏ２４质粒和ＢＳ质粒上的番木瓜环斑病毒外壳蛋白（ＰＲＳＶ—ＣＰ）基因和柞蚕抗菌肚Ｄ（ＣｅｃｒｏｐｉｎＤ）基因为材料，构建了单抗表达载体ＦＫ３和ＰＣｏ２５，进一步构建了双抗植物表达载体ｐＫＰＴ。这为开展单抗和多抗植物基因工程的研究提供了重要途径。

外壳型病毒的交叉感染

本文介绍了外壳型病毒及其交叉感染,以“掉眼泪”病毒和“维也纳”,病毒为例,给出了交叉感染的实验结果及分析,指出了外壳型病毒交叉感染对计算机造成的危害。

长臂光敏生物素标记葡萄扇叶病毒外壳蛋白基因cDNA探针的制备及其在检测上的应用

由葡萄扇叶病毒（Ｇｒａｐｅｖｉｎｅｆａｎｌｅａｆｖｉｒｕｓ，ＧＦＬＶ）导致的葡萄扇叶病在世界各地葡萄园内均有发生，是最为普遍和严重的病毒病害之一，感病葡萄可减产２０％～８０％。近年来，许多国家开展了葡萄脱毒苗木的培育和推广工作，同时进行了葡萄扇叶病毒...

外壳型病毒特征信息的获取及其消毒

以外壳型病毒为例,给出了获取病毒特征信息的一般方法,详细介绍了构造有效的反病毒软件的方法和实例.

给.EXE文件加上反病毒外壳

现在,有些软件,如SCAN等,具有自我修复的反病毒功能。这类软件在被病毒感染后,运行时会出现“文件已被修改,是否自我修复?”之类的提示,并能将自身复原。可以设想,如果每个软件都具有这种功能,文件型病毒就难以肆虐了。 基于这种想法,笔者编写了两个小程序SHELL.C和WARN.ASM,用于给需要保护的.EXE文件加上一层反病毒外壳,使其能察觉病毒的感染并进行自我修复。使用前要将warn.asm汇编,链接,再转换成warn.com,最后改名为warn.dat。shell.c当然是编译,

COM文件反病毒外壳生成器

新病毒层出不穷,简直令人防不胜防。下面的CURECOM.ASM经编译连接为CURECOM.COM后,按格式:CURECOM COM文件名执行,就可在COM文件原先的代码之上加一层反病毒外壳,该文件以后再被病毒感染,只需执行这个文件。

转PVY外壳蛋白基因马铃薯及其田间实验

报道了将马铃薯Ｙ 病毒（ＰＶＹ）中国分离株的外壳蛋白基因通过农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍ ｅｆａ－ｃｉｅｎｓ）介导转入马铃薯（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌ．）的生产品种“Ｆａｖｏｒｉｔａ”、“虎头”和“克４”，在获得大量再生植株的基础上经过ＰＣＲ检测和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交证明，大部分株系中ＰＶＹ 外壳蛋白基因的表达框架已完整整合到马铃薯的染色体上。人工接种ＰＶＹ 病毒（２０ ｍ ｇ／Ｌ）后一些转基因株系对ＰＶＹ 病毒的侵染表现较强的抗性，同时其单株结薯数和平均薯重有所增加。在田间实验中，转基因马铃薯植株生长良好而且部分转基因株系产量高于未转基因的脱毒马铃薯。

农杆菌介导法获得抗病毒病转基因大白菜

为获得抗芜菁花叶病毒病的大白菜植株,用携带TuMV-cp基因的农杆菌R1000和EHA105转化大白菜子叶和下胚轴,PCR、PCR-Southern检测证实TuMV-cp基因已导入并整合到大白菜的基因组中.RT-PCR检测表明TuMV-cp在转录水平上获得了稳定表达.TuMV-cp基因在转基因植株T1代中获得了稳定的遗传.抗病性鉴定结果表明转基因植株T1代较非转基因植株对TuMV的抗性增强,获得了抗病毒病的转基因大白菜植株.

三种葡萄病毒的RT-PCR检测和系统进化分析

【目的】为了研究不同葡萄病毒病快速检测方法和四川分离株系统进化,【方法】比较3种葡萄总RNA提取方法,还优化了葡萄病毒病的RT-PCR检测方法。分别克隆了3种病毒四川分离株的部分基因组区域,并开展了系统进化分析。【结果】结果表明,改进硅胶颗粒吸附法快速从葡萄枝条的韧皮组织中提取了总RNA,并以葡萄18SRNA为内参基因,RT-PCR分别成功扩增出3种病毒的目的片段。把16个地理起源的GLRaV-2分离株的外壳蛋白基因(Coat protein,CP)分成5个系统进化组。而7个地理起源的GVB分离株CP同源性为79.1%～98.7%。此外,5个GVA四川分离株分别位于系统进化树的4个聚类群。【结论】GLRaV-2、GVB和GVA不同地理起源的分离株在核酸水平上具有变异性,其中GVA四川分离株之间具有显著的遗传差异,可能包括4种株系。

香菇病毒快速检测

应用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳分析香菇菌丝蛋白质,根据能否检出22 000道尔顿的34nm香菇病毒外壳蛋白带作为菌株是否带病毒的指标。在生长不正常香菇菌株和对照的带病毒菌株中均检测出了34nm香菇病毒外壳蛋白带。这一结果表明,应用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可对香菇病毒进行简单、快速的早期检测。

A组轮状病毒结构蛋白基因在马铃薯细胞中的初步表达

目的 在马铃薯细胞中表达轮状病毒结构蛋白。方法 采用RT PCR扩增截短VP4 蛋白基因 ,克隆于植物表达载体pBI2 2 1,再双酶切pBI2 2 1,将带有CaMV35S启动子、外源基因及终止子的片段转入pSB11,通过三亲杂交方法 ,制备农杆菌转化载体pSB111 VP4 ,并对pSB111 VP4 作点杂交检测 ,筛选鉴定重组子 ,对马铃薯组织细胞进行转化。结果 转化细胞经Western印迹检测其免疫活性 ,具有良好的抗原性。结论 为研制轮状病毒重组疫苗、亚单组疫苗。

转基因抗病毒线辣椒果实品质分析

1998和 1 999年 ,以受体品种陕 82 1 2为对照 ,按照国家辣椒干质检标准和陕西省辣椒综合标准比较研究了转基因抗病毒线辣椒 T4 和 T5代的果实品质。结果表明 ,转基因线辣椒保持了受体品种的果型、皱折均匀度和色泽 ,而单果鲜重、果实长度以及干椒的水分、灰分、盐酸不溶性灰分、粗纤维、粗脂肪和辣椒素的含量都与对照相近或优于对照。

番木瓜环斑病毒CP基因同源区段的克隆及植物表达载体的构建

采用RT-PCR技术对番木瓜环斑病毒CP基因的同源区段进行了克隆和鉴定分析。序列分析结果表明,获得PRSV-CP基因3′端的278bp DNA片段同源率最高。构建了目的基因包含278bp正义链、内含子(PDK内含子)及278bp反义链的RNA介导的植物表达载体p2301-CPU,并通过电激法导入农杆菌中。经PCR及酶切鉴定,证实质粒已被导入获得了农杆菌工程菌株。利用该植物表达载体对番木瓜的遗传转化工作目前正在进行中。

PRSV—外壳蛋白基因在转基因番木瓜中的表达

用酶联免疫吸附试验（ＥｎｚｙｍｅｌｔｉｎｋｃｄＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂｒｎｔＡｓｓａｙ ＥＬＩＳＡ）和蛋白质免疫印迹技术（ｗｅｓｔｅｒｍｂｌｏｔ）．对番木瓜环斑病毒外壳蛋白（ＰＲＳＶ－ＣＰ）基因转基因植株进行表达蛋白的检测。ＥＬＩＳＡ的结果表明，外壳蛋白基因已在转基因番木瓜中表达；ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析结果表明，外壳蛋白基因在转基因植株中的表达产物具有与天然蛋白同样的大小及相同的血清学反应。

植物抗病毒的基因工程

本文就利用基因工程手段防治植物病毒病的主要策略进行了综述。所涉及的方法包括病毒基因组的和非病毒的,甚至非植物基因的转基因表达。对比了不同方法的特点,针对广谱抗性策略的开发是当前研究趋向之一。