抗肠道病毒71型外壳蛋白1卵黄抗体的制备和鉴定

目的 克隆肠道病毒71型（EV71）BrCr株外壳蛋白1（VP1）基因,构建原核表达载体PET28a/VP1,表达VP1重组蛋白,以VP1免疫产蛋母鸡,获得抗VP1的鸡免疫球蛋白（IgY）.方法 培养Vero细胞,利用Vero细胞增殖肠道病毒EV71 BrCr株,提取病毒总RNA,利用RT-PCR扩增出VP1目的基因,目的基因插入克隆载体pGEM-T,提取重组质粒,经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切获得目的基因,插入原核表达载体pET-28a,重组子同时BamHⅠ,EcoRⅠ双酶切和测序鉴定,转化入感受态工程菌E.coli BL21（DE3）,获得阳性重组工程菌,经IPTG诱导获得表达融合蛋白,试剂盒纯化蛋白,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定后,用VP1蛋白免疫开产母鸡,收集鸡蛋,利用EGG stractTM IgY Purification System试剂盒提取卵黄抗体IgY,间接ELISA测滴度,SDS-PAGE和Western blotting验证其表达量和免疫活性.结果 本实验成功扩增出肠道病毒EV71 BrCr株VP1基因,获得了含重组表达质粒pET28a/VP1的阳性工程菌株,经IPTG诱导能高效表达VP1蛋白,VP1经SDS-PAGE和Western blotting鉴定后,利用纯化后VP1蛋白免疫产蛋母鸡,提取的IgY经ELISA 鉴定后其滴度为1：104,SDS-PAGE和Western blotting证实为抗VP1的特异性IgY.结论 成功的从EV71 BrCr株扩增出VP1基因,构建了PET28a/VP1表达载体,获得高效表达融合蛋白,免疫产蛋母鸡后制备高效价抗VP1蛋白的特异性IgY.

肠道病毒71型外壳蛋白VP1全长在大肠杆菌中的高效表达及初步活性测定

目的:重组表达肠道病毒71型(EV71)外壳蛋白VP1全长,用于研制血清学检测试剂和疫苗研发。方法:在获得EV71全长基因并测序正确的基础上,将外壳蛋白VP1全长基因克隆到表达载体pET28a(+)上,构建重组表达质粒pET28a(+)/VP1,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,采用双抗原夹心检测技术评价重组抗原与27份EV71抗体阳性血清和18份阴性血清的反应情况。结果:重组EV71-VP1蛋白在大肠杆菌中诱导6 h后可获得高效表达,能与27份EV71抗体阳性血清中的21份发生阳性反应,EV71双抗原夹心检测与中和血清测试结果具有很好的一致性(P<0.05)。结论:实现了肠道病毒71型外壳蛋白VP1的高效表达,为肠道病毒71型诊断试剂和疫苗的研究奠定了基础。

禽脑脊髓炎病毒内蒙分离株外壳蛋白VP1基因在大肠杆菌中的融合表达及活性分析

为研制禽脑脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus,AEV)亚单位疫苗,对AEV-NH937内蒙分离株外壳蛋白VP1基因进行融合表达、纯化及活性分析.根据AEV-NH937基因组全序列,设计一对引物.利用RT-PCR技术,扩增AEV的外壳蛋白VP1基因.经序列分析,VP1基因编码区为810bp,编码270个氨基酸残基.将VP1基因插入载体pGEX-4T1构建表达重组质粒,然后转化大肠杆菌BL21.经IPTG诱导后,用聚丙稀酰氨凝胶电泳分析,结果表明,有融合蛋白表达,其分子量为56KD.纯化后,利用ELISA检测分析VP1蛋白,证明VP1蛋白有一定的抗原活性.

临床宫颈组织标本HPV16 L1蛋白检测

目的检测HPV16阳性宫颈标本L1蛋白的表达,研究宫颈损伤程度与L1蛋白表达的规律。方法应用PCR法对宫颈炎、宫颈上皮内瘤变(CINⅠ～Ⅱ)、原位癌、早期浸润癌及中晚期癌标本进行型别检测,ELISA法及免疫组化法检测HPV16阳性标本中HPV L1蛋白表达。结果 54例宫颈组织中HPV16阳性为46例(85.2%)。随着宫颈损伤加重,HPV16阳性标本的抗原抗体反应逐渐减弱;免疫组化阳性反应仅出现于上皮组织内,反应强度及分布与宫颈损伤程度及癌变组织的分化状态有关。结论 HPV16 L1蛋白的表达同时受宫颈组织损伤程度及宿主细胞分化状态的影响。早期对HPV L1蛋白进行检测,可为宫颈癌的早期预防及临床诊治提供理论指导。

EV71与CB3病毒VP1融合蛋白的构建表达与抗原性初步评价

目的构建pET-22b-ECVP1表达载体,在大肠杆菌中诱导表达肠道病毒71型(EV71)及柯萨奇B3型(CB3)病毒VP1融合蛋白(ECVP1),并鉴定其抗原性。方法利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法分别从EV71与CB3病毒基因组中扩增得到外壳蛋白VP1基因,经重叠延伸PCR(SOE-PCR)方法拼接构建重组融合蛋白基因(ecvp1),将该片段连接到pET-22b表达载体上,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达融合蛋白,经Western blot鉴定其抗原性。结果pET-22b-ECVP1表达载体构建成功,融合蛋白相对分子量约为65 ku,Western blot分析表明,该融合蛋白能被抗EV71及抗CB3抗体特异识别。结论成功构建pET-22b-ECVP1表达质粒并诱导ECVP1融合蛋白表达,且融合蛋白具有良好的抗原性。

肠道病毒71型重组VP1蛋白的原核表达及初步鉴定

目的利用大肠杆菌原核表达系统表达并纯化肠道病毒71型(EV71)VP1蛋白,并对重组蛋白功能进行初步鉴定。方法 PCR扩增EV71VP1全长基因,在测序正确的基础上,将其插入表达载体pET28a(+),构建表达质粒pET28a(+)/VP1,转化表达菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,利用Ni 2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,经ELISA和Western Blot,验证EV71VP1的抗原性。结果成功构建pET28a(+)/VP1重组质粒,经大肠杆菌表达、纯化获得分子量约为43kDa的融合蛋白,经ELISA和Western Blot,结果显示该蛋白有良好的抗原性。结论实现了肠道病毒7l型VP1蛋白的原核高效表达,为肠道病毒71型诊断试剂和疫苗的研究奠定基础。

肠道病毒71型外壳蛋白VP1基因克隆、表达及活性鉴定

肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（CoxA16）是引起手足口病最为常见肠道病毒，其中EV71是引起当前我国手足口病的病原优势株。目前临床对EV71感染以对症治疗为主，尚无有效的抗病毒药物，研制安全有效的疫苗和早期诊断试剂是预防控制手足口病疫情的经济有效地措施，为此进行以下相关研究。

柯萨奇病毒A6外壳蛋白VP1基因重组表达及活性鉴定

目的表达柯萨奇病毒A6(CVA6)外壳蛋白VP1,鉴定重组蛋白免疫活性,为CVA6血清学检测试剂和疫苗研究提供依据。方法利用PCR技术从HN421/HN/CHN/2011河南分离株基因组扩增VP1基因,经酶切连接到表达载体p ET30a中,转化大肠杆菌(BL21DE3);用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的基因表达,并对重组蛋白进行纯化,SDSPAGE和Western blot方法对重组蛋白分析鉴定其免疫活性。结果 PCR方法扩增的VP1基因长度为980 bp;经PCR扩增和测序鉴定插入到表达载体的基因片段与预期目的片段相一致;SDS-PAGE结果显示表达产物分子量为34 k Da;经大肠杆菌高效表达和纯化获得了重组蛋白CVA6-VP1,通过Western blot分析,该重组蛋白与手足口病患者血清反应产生特异杂交带。结论本研究成功克隆并构建了CVA6 VP1基因高效原核表达系统,初步结果显示重组蛋白具有较好的抗原性,为EV71诊断试剂的研究奠定了基础。

柯萨奇病毒A组6型VP1与白喉毒素无毒突变体GRM197融合蛋白的原核表达及其免疫原性

目的原核表达柯萨奇病毒A组6型(coxsackievirus A6,CVA6)VP1蛋白与白喉毒素无毒突变体CRM197片段A的融合蛋白(CRM197A-CVA6 VP1),并评价其免疫原性。方法将经密码子优化的CRM197A基因与CVA6 VP1基因连接,克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-CRM197A-CVA6 VP1,转化感受态E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达目的蛋白,经Ni-NTA柱层析及透析复性后获得重组蛋白CRM197A-CVA6 VP1,检测重组蛋白的粒径及电位,并进行蛋白荧光光谱检测。经沙鼠腹腔注射免疫铝佐剂吸附的重组蛋白CRM197A-CVA6VP1,20μg/(只·0.5 mL),同时设对照组(等体积的铝佐剂);1周后进行加强免疫,免疫途径及剂量同上。首次免疫后4周,经沙鼠眼眶采血,分离血清,ELISA法检测血清结合抗体,微量细胞病变法检测血清中和效价。相同方法对沙鼠进行分组及给药,于初次免疫4周后,经沙鼠腹腔接种CVA6病毒液,1×10^(4)TCID_(50)/只,观察沙鼠的存活情况。结果测序结果表明,重组表达质粒pET-28a-CRM197A-CVA6 VP1构建正确。重组蛋白CRM197A-CVA6 VP1的粒径为81.16 nm,电位为23.12 mV,280 nm激发光下检测到最大发射波长为353 nm,纯度达88.3%。试验组及对照组沙鼠血清中结合抗体效价的几何平均数分别为44565和0,中和抗体效价的几何平均数分别为30.4和0,两组间结合抗体效价和中和抗体效价的几何平均数差异均有统计学意义(P均<0.05)。对照组沙鼠于攻毒后第3天开始出现死亡,第13天全部死亡;试验组沙鼠在攻毒过程中未发现死亡,保护率达100%。结论原核表达的重组蛋白CRM197A-CVA6 VP1在沙鼠体内可产生良好的免疫原性。

南京市2012年-2013年肠道病毒71型分离株VP1基因特性分析

目的了解南京地区肠道病毒71型流行株的遗传学背景。方法采集2012年-2013年手足口病患者咽拭子样本,经特异性逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）鉴定EV71病毒核酸阳性者进行细胞接种分离病毒。选取阳性分离株扩增其VP1完整编码区全长基因并进行序列测定,利用生物信息学软件对序列加以分析,构建序列遗传亲缘关系树。结果共分离得到14株EV71毒株,经VP1全长基因测序分析发现,所分离病毒VP1区核苷酸与EV71病毒A型代表株同源性为79.6%～81.3%,与B型代表株的同源性为81.7%～84.7%,而与C型代表株的同源性明显较高,为86.0%～95.2%,其中与C4代表株（AY895144）的同源性最高,为93.8%～95.2%。进化树分析发现本地流行株与上海、安徽等地区流行株的亲缘较近,而与台湾地区流行株亲缘较远。相应的氨基酸位点分析也表明符合C基因型的氨基酸模式。结论南京地区2012年-2013年肠道病毒71型的流行株主要为C4亚型,与上海和安徽地区流行株亲缘较近,可能具有同一来源。

EV71临床毒株分离及其VP1单克隆抗体制备

目的对手足口病肠道病毒71型(EV71)流行临床株进行分型和鉴定,制备抗EV71外壳蛋白VP1的特异性单克隆抗体,为EV71生物学特征研究和疫苗株的筛选奠定基础。方法从患者咽拭子中分离出流行的EV71毒株,原核表达纯化该毒株EV71 VP1衣壳蛋白,以此蛋白为免疫原制备VP1的特异性小鼠单克隆抗体,采用免疫荧光法(ELISA)观察抗体能否特异性识别EV71感染的细胞。结果测序结果显示分离出的EV71病毒株为肠道病毒C4亚型。筛查出12株分泌针对VP1蛋白的抗体杂交瘤细胞株,将其中结合特异性和结合力最强的一株命名为11T12。复苏的11T12活化后接种于液体石蜡免疫的小鼠腹腔,收集腹水经过protein-G柱纯化后对抗体的效价进行ELISA评价,结果显示纯化抗体稀释10万倍后仍可以结合蛋白,证实成功制备了抗EV71 C4亚型外壳蛋白VP1单克隆抗体。抗体结合特征分析结果显示该抗体具有特异性识别能力。结论从感染的临床样本中分离到一株C4型EV71毒株,以该病毒VP1蛋白为免疫原获得一株相应的单克隆抗体11T12,该单克隆抗体的获得为病毒的检测、试剂盒的研发提供了核心材料。