谷氨酸棒杆菌中L-半胱氨酸外排蛋白的鉴定及应用

L-半胱氨酸是一种重要的含硫氨基酸,被广泛应用于食品,医药,化妆品等行业。有效的外排蛋白不仅可以降低反馈抑制和细胞毒性,还能提高菌体的生产能力。在细胞工厂的构建中发挥重要作用。该研究基于转录组测序分析,在谷氨酸棒杆菌中发现一种新的L-半胱氨酸外排蛋白Cg1298-Cg1299。当添加7.5 mmol/L L-半胱氨酸时,cg1298-cg1299缺失菌株的生长比对照菌株降低了约24.2%,而回补菌株恢复了对半胱氨酸的抗性。利用Cys-Tyr二肽进一步检测Cg1298-Cg1299对半胱氨酸的外排能力,发现cg1298-cg1299双敲菌株的L-半胱氨酸外排能力下降了26.3%。最后,在L-半胱氨酸底盘菌中过表达cg1298-cg1299使得L-半胱氨酸产量提高17.1%。综上所述,Cg1298-Cg1299是谷氨酸棒杆菌中一种新的L-半胱氨酸外排蛋白,其显著增强了谷氨酸棒杆菌对L-半胱氨酸的耐受性,并提高了L-半胱氨酸的生产能力,为将来构建高产L-半胱氨酸的细胞工厂提供了一个有效靶点。

金葡菌主动外排蛋白QacAα-螺旋13氨基酸的功能研究

目的评价金葡菌多药耐药主动外排蛋白QacAα-螺旋13位于细胞膜侧的氨基酸对于底物转运的重要性。方法用半胱氨酸定点诱变的方法突变E407,S408,M409,Y410,D411和L412,测序确定突变后,测定最低抑菌浓度(MIC)和进行运输试验比较突变前后细菌转运功能的变化。结果MIC分析表明突变株E407,Y410和D411耐药性显著降低,运输实验结果与MIC结果一致,提示这3株突变株失去对底物的转运能力。结论QacA蛋白α-螺旋13上的3个氨基酸可能与底物的结合和转运功能密切相关。

真菌多药耐药相关的外排蛋白基因研究进展

真菌的多药耐药现象日益严重,受到人们广泛重视。外排蛋白表达增强,导致细胞内药物浓度降低是产生多药耐药的重要机制。本文就外排蛋白分类、结构、功能、相关基因及其调控因子的研究进展作一综述。

基于ABC外排蛋白介导的中药七情配伍的药动学机制研究进展

ABC外排蛋白是一类依赖ATP水解释放的化学能，介导机体多种内源性和外源性外排蛋白底物的跨膜转运。其广泛存在于人体的各种组织器官中，是人体内重要的功能性膜蛋白。药物改变转运蛋白的表达和（或）功能，将会影响该转运蛋白对应底物药物的体内处置过程，产生药动学方面的相互作用。外排蛋白主要由P．糖蛋白（P-glyeoprotein，P-gP）、多药耐药相关蛋白（multidrug resistance associated protein，MRP）、乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）组成，能够对药物在体内的吸收、分布、代谢、排泄过程产生影响。药物对外排蛋白的诱导或抑制作用是中药配伍使用时产生相互作用的重要因素，这种作用可能是七情配伍理论的重要机制之一。该文就七情配伍对ABC外排蛋白的影响进行了简要综述，以揭示外排蛋白在药对配伍中的作用．为中药配伍机制和合理性提供新思路。

多药及毒素外排转运蛋白遗传药理学研究进展

人体的肝脏、肾脏和肠道上广泛分布着多种转运蛋白,其中多药及毒物外排转运蛋白(MATEs)主要表达在肾脏近端小管的刷状缘膜及肝细胞胆小管面,其功能主要是调节有机阳离子的外排。该文主要讨论的是MATEs家族的成员MATE1和MATE2-K的分型、结构、遗传多态性以及其功能意义,同时也就MATEs的遗传多态性对铂类化合物及二甲双胍药物代谢动力学以及药效学的影响进行阐述。

染料木素对MRSA外排蛋白表达的影响

【目的】研究染料木素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)外排蛋白的影响。【方法】通过联合药敏实验检测染料木素影响MRSA对环丙沙星的敏感性;利用等重同位素多标签相对定量蛋白质组学(iTRAQ)技术,检测染料木素作用MRSA41577后菌体蛋白表达量的变化;通过生物信息学方法对差异显著的蛋白进行系统分析;通过qPCR和尼罗红外排实验,探讨耐药相关的蛋白介导细菌耐药的作用机制。【结果】联合药敏实验结果显示,染料木素能增强MRSA对环丙沙星的敏感性;通过iTRAQ技术检测到差异显著蛋白共有129个,包括60个表达上调的蛋白和69个表达下调的蛋白;生物信息学分析结果显示,与细菌耐药相关的蛋白约有14个,其中,通过主动外排系统介导细菌耐药的蛋白主要有PstB、PstS等;qPCR结果显示,与对照组相比,PstB、PstS的基因表达量分别下降了51.6%和78.6%;尼罗红外排实验结果显示,染料木素与尼罗红之间存在竞争关系,为MRSA41577的竞争性抑制剂。【结论】染料木素可通过降低MRSA41577外排基因pstB和pstS的mRNA表达量,进而影响PstB、PstS外排蛋白的表达来逆转细菌耐药;此外,染料木素还是MRSA41577的竞争性外排抑制剂,可通过与底物竞争外排的方式,使抗菌药物留在菌体内发挥抗菌作用。

观赏植物糖转运蛋白研究进展

观赏植物因其花、叶、果实等具有良好的观赏价值而在环境美化中得到广泛应用。糖转运蛋白在观赏植物生长发育、开花结实以及逆境胁迫响应等方面发挥重要作用,因此,研究糖转运蛋白对观赏植物产生的影响具重要意义。单糖转运蛋白、蔗糖转运蛋白和糖外排转运蛋白是目前植物中发现的3大类糖转运蛋白。本文对这3类糖转运蛋白成员的分类及基本特性进行了比较和讨论,重点介绍了观赏植物中糖转运蛋白功能和调控的最新研究进展,以期为今后利用基因工程技术改良观赏植物并提高其观赏性及适应性提供理论依据。

多粘菌素外排转运蛋白的研究进展

多粘菌素是一种脂肽类抗生素,对大部分革兰氏阴性菌和小部分革兰氏阳性菌具有杀菌作用。多粘菌素主要由多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)在胞内产生,再通过外排转运蛋白转运到胞外,外排转运蛋白运输多粘菌素的能力在一定程度上影响了多粘菌素的产量。多粘菌素外排转运蛋白主要存在于多粘类芽孢杆菌中,在一些多重耐药细菌中也广泛存在。本文重点介绍已鉴定的多粘菌素外排转运蛋白的类型、结构和转运特征等研究进展,以期为多粘菌素跨膜分泌机制的深入研究提供理论基础。

病原真菌外排转运蛋白与真菌耐药的研究进展

病原真菌通过对抗机体防御系统和抗真菌药物的攻击,从而成功定植于宿主体内并最终导致机体感染,真菌外排转运蛋白在上述过程中起着重要作用,主要包括ATP结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette transporters,ABC)与主要易化子超家族(the major facilitator super family,MFS),分别通过与ATP水解酶或质子梯度耦合来运输并清除真菌胞内的毒性物质。与其它生物相比,真菌基因组中具有更多转运蛋白家族编码基因,这些转运蛋白不仅对真菌致病过程中所产生的代谢产物和宿主细胞分泌的抗菌成分起外排作用;同时,在病原真菌对抗临床抗真菌药物中也发挥着重要作用。本文就这两个超家族的转运蛋白在主要病原真菌耐药性中所发挥的作用进行综述。

外排转运蛋白在眼部给药中的研究动态

外排运转蛋白是一种广泛分布于人体全身组织器官的细胞膜转运蛋白，它可以将进入细胞内的外源性物质，包括药物等转运出细胞外，对细胞起到保护作用。近年研究表明，该蛋白亦分布于角膜、虹膜、睫状体、视网膜神经上皮和视网膜色素上皮（RPE）等眼部组织，每种转运蛋白都有其相对应的特异性底物及抑制剂。外排转运蛋白通过其对药物的外排转运功能影响不同给药途径中药物在眼内的利用和分布。深入研究外排运转蛋白药物的吸收和分布，清除时所起的作用，有助于进一步了解眼部给药的机制和设计给药方略，为临床眼部给药和给药途径的开发提供更多的科学依据。

附子水提物对大鼠十二指肠外排转运蛋白和紧密连接蛋白表达的影响

目的:研究附子水提物对大鼠十二指肠组织中3种外排转运蛋白和3种紧密连接蛋白及其基因表达的影响。方法:取32只SD雄性大鼠,随机分为正常组和附子水提物低、中、高剂量组[0.45、0.9、1.8g/(kg·d),以生药量计算],每组8只,分别灌胃水和相应药液0.1mL/kg,连续给药7d。末次给药后,取大鼠十二指肠肠段,采用Western blotting法检测肠组织中P-糖蛋白(P-gp)、乳腺癌耐药蛋白(Bcrp)、多药耐药蛋白2(Mrp2)为代表的外排转运蛋白和密封蛋白(Claudin-1)、闭合蛋白(Occludin)、闭锁小带蛋白(ZO-1)为代表的紧密连接蛋白的表达水平;采用实时定量聚合酶链式反应法测定上述6种蛋白对应基因的mRNA表达水平。结果:与正常组比较,附子水提物各剂量组大鼠十二指肠组织中P-gp、Mrp2、Bcrp、Claudin-1、Occludin、ZO-1的蛋白表达水平均显著升高(P<0.01);附子水提物各剂量组P-gp的mRNA表达水平,附子水提物低、高剂量组Bcrp的mRNA表达水平以及附子水提物中、高剂量组Claudin-1的mRNA表达水平均显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01),其余基因的mRNA表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:附子水提物可从mRNA和/或蛋白水平上调3种外排转运蛋白和3种紧密连接蛋白的表达,从而可能与上述外排转运蛋白的其他底物类药物以及以细胞旁路途径为主要转运通道的药物发生相互作用,在临床上联合用药时可考虑对用药剂量作相应调整。

生物素对发酵过程中MscCG外排L-谷氨酸的影响

谷氨酸棒杆菌发酵产生的谷氨酸主要是通过外排蛋白在细胞膜拉伸时打开通道从而将谷氨酸排至胞外。由于培养基中的生物素会影响细胞膜成分从而影响膜张力,因此生物素的浓度会间接影响谷氨酸外排蛋白的能力和胞外谷氨酸的积累量。研究表达谷氨酸外排蛋白MscCG对谷氨酸棒杆菌发酵生产L-谷氨酸的影响,并利用M2P BioLector微型生物反应器在线检测发酵过程中的生物量、溶氧及pH的变化。结果表明,生物素对MscCG外排谷氨酸影响很大,0.5μg/L生物素是本实验条件下的亚适量,在此生物素浓度下外排蛋白MscCG排出谷氨酸的量达到最高;低于亚适量,菌体生长速度缓慢从而谷氨酸产量降低;高于亚适量,菌体生长速度快但谷氨酸浓度低,发酵液中溶氧缺乏导致乳酸积累。因此,发酵过程中需综合考虑对生物素浓度、溶氧及pH值的动态控制,以期达到谷氨酸发酵的最高水平。

拟南芥MATE转运蛋白DTX6参与镉离子的胞内运输

重金属镉是自然界广泛存在的一种环境污染物.镉离子可对动植物产生巨大的毒害作用,它通过食物链在人体内富集,最终严重威胁人类健康.在植物中,多药及毒素化合物外排蛋白(Multidrug and Toxic Compound Extrusion,MATE)可能参与包括铁(Fe^2+)、锌(Zn^2+)、铝(Al^3+)以及镉(Cd^2+)在内的金属离子的运输.实验室利用反向遗传学手段研究发现,拟南芥MATE转运蛋白DTX6(Detoxification 6)具有转运镉离子的能力,基因敲除突变体表现出对镉离子的抗性,在酵母中过表达DTX6使得酵母对镉离子极为敏感,而在拟南芥中过表达DTX6则抗镉表型不明显.进一步发现DTX6主要在根和下胚轴中表达,在酵母和拟南芥原生质体中,DTX6蛋白均定位于点状的囊泡结构中,与高尔基体存在共定位,据此我们推断DTX6可能参与镉离子在胞内的运输.

多重耐药鲍曼不动杆菌β-内酰胺酶、膜孔蛋白及β-内酰胺类靶位编码基因研究

目的研究一株多重耐药鲍曼不动杆菌(Multi-drug-resistant Acinetobacter baumannii,MDR-ABA)J65可能存在的β-内酰胺类药物耐药机制。方法 MDR-ABA J65株分离自2011年12月某三甲医院住院患者痰标本,用gyrA和parC基因PCR扩增、测序和BLASTn比对确认菌种。用PCR法分析该菌株的PBP1a、PBP2、CarO和33种A^D类β-内酰胺酶编码基因,并对检出的β-内酰胺酶编码基因作了插入序列与β-内酰胺酶编码基因连锁检测。结果 MDR-ABA J65检出β-内酰胺酶编码基因bla TEM-1、bla ADC-62、bla OXA-23、bla OXA-66,插入序列与β-内酰胺酶编码基因连锁检测显示ISaba1-ADC-62和ISaba1-OXA-23为阳性。PBP1a、PBP2和CarO编码基因序列与鲍曼不动杆菌敏感株(SDF)相比均存在有义突变,且三维结构同源建模显示,与SDF株PBP1a、PBP2和CarO蛋白分子立体结构有明显差别。结论 MDR-ABA J65对β-内酰胺类耐药机制为PBPs和孔蛋白CarO变异及可移动遗传元件介异的β-内酰胺酶编码基因。

P-糖蛋白的核酸适配体筛选及应用研究

基于SELEX技术筛选P-糖蛋白(permeability glycoprotein,P-gp)的特异性核酸适配体(aptamer,Apt),并用酶联免疫吸附测定(ELISA)法、表面等离子体共振(SPR)法表征了Apt与P-gp的结合能力,采用与P-gp结合能力最强的Apt5在人结直肠腺癌细胞(Caco-2)、人脑微管内皮细胞(hCMEC/D3)两种细胞系上考察了对P-gp外排功能的抑制效果.筛选得到10条长度为81 bp的P-gp核酸适配体,结合能力大小顺序为:Apt5>Apt8>Apt1>Apt4>Apt6>Apt10>Apt7>Apt2>Apt9>Apt3.Apt5使hCMEC/D3及Caco-2细胞内罗丹明123的蓄积量分别增加了40.77%(P<0.01),32.39%(P<0.05),能潜在抑制P-gp的外排功能.本研究首次报道了P-gp的多条核酸适配体,与P-gp有较强的结合能力,并能抑制P-gp的外排功能,有望成为P-gp的潜在新型抑制剂.

雌激素缺乏对去卵巢大鼠二甲双胍尿排泄的影响（英文）

目的:研究二甲双胍在去卵巢大鼠(雌激素缺乏模型)体内的药代动力学,在血浆、组织(肝、肾)、尿液中的质量浓度以及有机阳离子转运体2(rOct2)与多药和毒素外排蛋白1(rMate1)的蛋白表达情况.方法:将大鼠随机分为两组,卵巢切除术组(Ovx,去除双侧卵巢)和假手术组(除了不去除双侧卵巢,其余处理均与Ovx组一致)各8只,均给予二甲双胍治疗.采用高效液相色谱法测定血浆、尿液和组织中二甲双胍的质量浓度,生化分析法测定血浆乳酸(LCA)浓度,Western-blot法测定大鼠肾组织中rOct2和rMate1的表达.结果:Ovx组的二甲双胍药动学参数AUC0→t和组织浓度均明显高于假手术组(P<0.01),24h累积尿排泄量明显低于假手术组(P<0.01);与假手术组比较,Ovx组的rMate1的蛋白表达下降而rOct2的蛋白表达显著增加(P<0.01),血乳酸浓度显著升高(P<0.05).结论:二甲双胍尿排泄减少与大鼠卵巢切除术后雌激素缺乏有关.

食用酸枣仁多糖的小鼠肠道菌群培养上清液对Caco-2细胞吸收相关蛋白表达的影响

为了探究食用酸枣仁多糖(ZSSP)的小鼠肠道菌群培养上清液是否会调节Caco-2细胞中外排转运蛋白、紧密连接蛋白和Ⅱ相代谢酶的表达水平。将20只C57BL/6小鼠随机分为对照组和ZSSP组,分别灌胃超纯水和酸枣仁多糖水溶液(100 mg/kg·d^-1)14 d,收集小鼠粪便制备肠道菌群培养上清液。采用噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测肠道菌群培养上清液对Caco-2细胞活力的影响,采用免疫印迹(western blot,WB)法检测Caco-2细胞中P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、多药耐药相关蛋白2(multidrug resistance-associated protein 2,MRP2)、咬合蛋白(Occludin)和闭合蛋白1(Claudin-1)的表达水平,用酶联免疫检测(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒测定磺酸基转移酶(sulfotransferase,SULT)和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶(UDP-glucuronosyltransferase,UGT)的含量。结果表明,ZSSP组的肠道菌群培养上清液能显著降低Caco-2细胞中外排转运蛋白(P-gp和MRP2)的表达水平(P<0.05),显著升高UGT的表达水平(P<0.05),但对紧密连接蛋白(Occludin和Claudin-1)和SULT没有显著影响(P>0.05)。由此可知,食用酸枣仁多糖的小鼠肠道菌群培养上清液能调节Caco-2细胞中的外排转运蛋白和Ⅱ相代谢酶的表达水平。

多药耐药蛋白1在人与小鼠角膜及不同糖尿病病程小鼠角膜中的表达

目的本文拟以外排转运蛋白中的多药耐药蛋白1(multi-drug resistance protein 1,MDR1)为代表,研究其在人角膜上皮、C57BL/6小鼠角膜上皮、C57BL/6小鼠腹腔注射链尿佐菌素(Streptozocin,STZ)诱导Ⅰ型糖尿病动物模型不同糖尿病病程角膜上皮中的表达与分布差异,为眼部外排转运蛋白表达与功能调控研究提供基础数据。方法 PCR、免疫组化/免疫荧光、Western Blotting分别从基因与蛋白水平检测各组织内MDR1的表达,同时还检测了人角膜上皮细胞系(HCEC)中MDR1的表达。结果在基因水平,MDR1在人角膜上皮中表达仅为(9.11±2.33)Qty·ng-1 RNA,HCEC则未检测到表达,MDR1在C57BL/6小鼠角膜上皮中则有较强的表达,但是与正常组相比,STZ小鼠角膜上皮中的MDR1表达在建模4周、12周和24周均呈现显著下降(P<0.05),正常小鼠和STZ模型小鼠随着鼠龄的增长,角膜上皮中的MDR1基因表达也均呈现出显著下降的趋势(P<0.05)。Western Blotting结果表明MDR1在人角膜上皮组织内表达,但表达量很低,MDR1在HCEC细胞内明显表达,在Ⅰ型糖尿病动物模型小鼠角膜上皮中表达但是变化趋势同基因表达变化趋势一致;免疫组化/荧光检测结果表明MDR1人角膜全层部分上皮细胞细胞核核周表达,在HCEC细胞中有表达,其表达部位均位于整个胞浆,MDR1在小鼠角膜组织内表达,且与空白组相比,STZ组小鼠角膜MDR1表达下降。结论人角膜上皮组织中MDR1表达与C57BL/6小鼠存在较大差异,且随着鼠龄增长MDR1表达也呈下降趋势,如基于C57BL/6小鼠等动物进行MDR1外排转运蛋白的研究和调控有可能偏离人组织的实际表达情况而得到错误结论。

结核分枝杆菌耐药性相关膜蛋白MmpL6的表达与纯化

目的构建结核分枝杆菌外排泵蛋白MmpL6(Rv1557)表达载体,在大肠杆菌E.coli中诱导MmpL6蛋白高表达并进行纯化。方法以结核分枝杆菌H37Rv菌株基因组DNA为模板,采用聚合酶链反应扩增目的基因片段,构建pET21b-MmpL6表达载体。将表达载体转化至大肠杆菌中,加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,并针对不同表达菌株、温度进行优化,获取最优表达条件。采用Ni-NTA亲和层析以及凝胶过滤色谱纯化目标蛋白。结果成功构建pET21b-MmpL6重组表达质粒,经IPTG诱导后,在Rosetta菌株中25℃条件下获得最高表达量。结论成功表达并纯化了MmpL6蛋白,为该蛋白后续的结构与功能研究奠定了基础。

多药及毒素外排转运蛋白研究进展

多药及毒性化合物外排转运蛋白(MATEs)在有机阳离子体内转运过程中发挥重要作用,涉及临床上多种常用药物和重要的内源性物质的最终排泄过程。本文对MATEs的发现、分型、基因编码及多态性、体内分布、底物及抑制剂的分类及研究方法等方面的研究进展进行综述,结合实例对研究意义进行分析。