外显子拼接复合体塑造m^(6)A表观转录组的形成

N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m^(6)A)是mRNA中含量最丰富的化学修饰之一,在各种生理病理过程中发挥关键性的作用。m^(6)A修饰主要位于mRNA终止密码子附近和长的内部外显子上,然而导致这一特异性分布的机制却一直不清楚。近期发表的3篇论文揭示了外显子拼接复合体(exon junction complexes,EJCs)作为m^(6)A修饰的抑制蛋白suppressors,塑造了m^(6)A表观转录组的形成,解决了这一重大问题。由此,本文简要介绍了m^(6)A修饰通路,并结合这些研究成果阐述了EJC对m^(6)A修饰形成的作用和机理,进而说明外显子-内含子结构通过m^(6)A修饰影响mRNA的稳定性,以期理解m^(6)A这一RNA表观修饰领域的最新进展。

外显子拼接法合成真菌灵芝漆酶基因cDNA

为真菌漆酶基因cDNA的克隆提供了一种简便快速的新方法．从含有内含子的灵芝漆酶基因出发，采用外显子拼接PCR方法，合成了灵芝漆酶的cDNA．设计了10对引物分别经PCR扩增该基因的10个外显子，引物设计使前一个外显子的下游引物与下一个外显子的上游引物都有一段同源匹配序列，然后通过两两片段混合作为模板PCR扩增得到两两拼接的外显子片段，再将得到的5个片段前两个混合，后3个混合分别作为模板扩增获得拼接好的外显子1～4大片段和外显子5～10大片段，最后将这两个大片段混合作为模板扩增得到拼接好的全长cDNA序列．与常规方法相比，该方法既避免了RNA的操作，又不用摸索酶表达的条件，可以和基因组步行技术结合快速获得真菌漆酶基因的cDNA．

IT-ISJ标记及其在陆地棉遗传图谱构建中的应用

【目的】开发可用于植物遗传多样性分析和遗传图谱构建的新型标记。【方法】根据植物结构基因内含子拼接位点的保守序列,设计扩增内含子的内含子-外显子拼接位点(intron targeted intron-exon splice junction,IT-ISJ)标记引物,并用于陆地棉遗传图谱构建。【结果】利用704个IT-ISJ引物组合,对陆地棉高品质品种渝棉1号和多显性基因标记系T586进行多态性筛选,获得49个多态性引物组合,占筛选引物的7.0%。49个多态性引物组合在(渝棉1号×T586)F2:7重组近交系群体270个系中检测到58个位点。以58个IT-ISJ、150个SSR和8个形态标记进行连锁分析,构建的遗传连锁图包括22个连锁群、113个位点(49个IT-ISJ、62个SSR和2个形态标记)。连锁图覆盖714.5cM,占棉花基因组的16.1%,标记间平均长度为6.3cM。【结论】IT-ISJ标记多态性高,可有效地用于陆地棉遗传连锁图谱的构建。

大鼠胰岛素样生长因子Ⅰ基因的克隆及表达

以大鼠染色体DNA为模板 ,PCR分别扩增胰岛素样生长因子Ⅰ (IGF Ⅰ )基因外显子 2编码区和外显子 3编码区 ,并使外显子 2编码区的 3′端与外显子 3编码区的 5′端有相同的 4 0个碱基。采用外显子拼接法 ,以两种扩增产物为模板再次进行PCR ,得到 2 10bp的大鼠IGF Ⅰ基因全编码序列。将此序列克隆入pUC18质粒进一步构建表达型重组质粒pGEX IGF Ⅰ ,并在大肠杆菌DH5α中进行诱导表达。表达产物经SDS PAGE分析及Westernblot检测 ,并经体外实验证明其具有刺激细胞增殖的生物活性。

人载脂蛋白CⅡ成熟肽编码基因的克隆

目的:克隆人载脂蛋白CⅡ(ApoCⅡ)成熟肽编码基因。方法:以人基因组DNA为模板,利用聚合酶链反应(PCR)分别扩增ApoCⅡ成熟肽的编码基因外显子3和外显子4,继而采用外显子拼接法,以两种扩增产物为模板再次进行PCR,得到246bp的人ApoCⅡ基因编码片段。将ApoCⅡ基因编码片段重组入载体pUC18,并进行序列测定。结果:PCR扩增得到ApoCⅡ基因编码片段,经测序证实重组入载体pUC18中的ApoCⅡ编码片段的序列与Genbank中所检索到的编码序列完全一致。结论:利用外显子拼接法完成人ApoCⅡ成熟肽基因编码片段的克隆,为基因工程研制有生物活性蛋白提供了可行的技术手段。

海甘蓝硫甙合成关键酶S-GT基因两种表达载体的构建

Thiohydroximate S-glucosylt ransferase(S-GT)是硫甙生物合成的一个关键酶。根据发表的甘蓝型油菜S-GT基因cDNA序列设计引物,以海甘蓝总DNA为模板进行PCR扩增,获得S-GT基因全长,构建了海甘蓝S-GT基因的植物双元表达载体pCambia2300sn-Ca SGT。用PCR的方法对CaSGT基因的外显子进行了拼接,将得到的序列正向插入到了大肠杆菌表达载体pET-32b(+)中,得到重组质粒pET-32b(+)-CaS-GT,为进一步研究CaSGT的生物学特性打下基础。