外显子捕获-高通量测序技术用于法洛四联症胎儿遗传学检测

目的用外显子捕获-高通量测序(exon-capture high-throughput sequencing,EC-HTS)技术寻找法洛四联症(tetralogy of fallot,TOF)胎儿可能存在的遗传学致病性证据,并探讨其在产前分子遗传学诊断中的价值。方法选择经超声心动图发现且G显带和微阵列比较基因组杂交(array-based comparative genomic hybridization,a CGH)分析结果均正常的9例TOF胎儿作为研究对象,以63个人类已知的先天性心脏病致病基因作为检测靶点制作捕获芯片,用EC-HTS技术进行检测,数据经过Calling、数据库比对、软件分析得到最终病理性突变位点;并用Sanger测序对其进行验证。结果在9例胎儿中共检测到单核苷酸多态性(SNP)位点732个,结果经过生物信息学分析得到致病性突变位点3个:CITED2 c.574_579 del AGCGGC(p.S192_G193del纯合突变,CHD7c.2550_2554 del GAGAA(p.K850Nfs*6)杂合突变,NOTCH2 c.4918T>C(p.F1640L)杂合突变。Sanger测序结果验证了这3个突变位点的真实存在,父母溯源检测发现这3个点突变均为新发突变。结论用靶向性EC-HTS技术发现了3例TOF胎儿存在病理性基因突变,可能为其致病的遗传学病因。

外显子捕获测序技术用于室间隔缺损胎儿遗传学病因检测

目的:探讨外显子捕获-高通量测序技术检测室间隔缺损(VSD)胎儿遗传学病因的可行性。方法:选择超声心动图诊断为VSD且微阵列比较基因组杂交(a CGH)和G显带检测结果均正常的19例胎儿作为研究对象;将已知的63个人类先心病致病基因作为检测靶点制作成捕获芯片,对各个样本DNA进行外显子捕获后高通量测序,数据经过滤、数据库比对、生物学软件分析得到最终病理性突变位点;病理性突变位点用Sanger测序验证。结果:19例VSD胎儿中共检测到1540个基因突变位点,数据库比对、生物信息学分析后得到8个病理性突变位点:JAG1 c.1078T>G(p.C360G),CHD7 c.6718G>T(p.D2240Y),NOTCH2c.6131G>A(p.R2044H),MYH7 c.77C>T(p.A26V),ZFPM2 c.2107A>C(p.M703L),CHD7 c.7198C>T(p.R2400W),HAND2 c.341G>A(p.S114N),MLL2 c.12140_12168del GGCCGTTAGCAATAGGAACTACCCCTGAG(p.G4047Vfs*5),其中MYH7、ZFPM2两个突变点为已报道突变,其余6例未见报道。8个突变位点的Sanger测序结果与高通量测序结果一致。父母溯源分析均为新发突变。结论:外显子捕获芯片用于VSD胎儿遗传学检测可提高阳性检出率,具有较好的临床应用价值。

靶向外显子捕获芯片制作及在家族性高胆固醇血症基因诊断中的应用

背景家族性高胆固醇血症（FH）是一类严重脂质代谢紊乱的单基因显性遗传性疾病，其主要致病基因有低密度脂蛋白受体（LDLR）、载脂蛋白B100（ApoBl00）、枯草溶菌素9（PCSK9）等六种致病基因。FH是早发冠心病的高危人群，早期明确诊断对于预防心血管病具有重要意义。由于缺乏高通量的筛查手段．在中国对于其基因诊断报道较少。北京安贞医院动脉硬化研究室与美国迈基诺公司共同研发FH致病基因靶向捕获芯片，结合二代测序不仅可检测患者已知6种基因突变位点，还可检测到血脂代谢相关基因的变异，对全面了解我国FH人群的遗传背景有重要意义。目的自行设计研制血脂代谢相关的基因靶向外显子捕获芯片，验证已知明确基因诊断的患者，证明该基因芯片的准确性。检测患者未知致病基因，选择基因诊断部分明确和未知的患者，明确诊断患者的未知基因突变，探讨基因芯片在我国FH基因诊断中的应用价值。方法（1）选择与血脂代谢相关的基因自行设计研制靶向外显子捕获芯片，以10例明确基因诊断的FH患者为对象，提取外周血DNA，

外显子捕获法分离FRAXA位点的新表达序列

外显子捕获是近年发展起来的一种自基因组ＤＮＡ分离表达序列的有效方法．我们采用以ｐＳＰＬ３为剪接载体的外显子捕获系统，从覆盖ＦＲＡＸＡ位点的酵母人工染色体ＹＡＣ２０９Ｇ４中分离到２个新外显子序列Ａ９１和Ｄ１２．Ａ９１在人胎肝和骨骼肌文库中丰度较高，在肝、肾和骨髓文库中也有ＰＣＲ扩增．而Ｄ１２在所分析的８个ｃＤＮＡ文库中均未见ＰＣＲ扩增产物．从骨骼肌文库中克隆到一段包含Ａ９１的３１５ｂｐ的ｃＤＮＡ（ＡＭ４４７０）．多种组织ＲＮＡ印迹显示，ＡＭ４４７０与骨骼肌和心脏ｍＲＮＡ杂交，转录本长度均为２８ｋｂ．

3＇末端外显子捕获：从脊椎动物DNA中确定基因

３＇末端外显子捕获：从脊椎动物ＤＮＡ中确定基因一些定位克隆方法的目的是为了阐明在这些ＤＮＡ区域存在可转录序列。一个主要的难题是大多数脊椎动物基因都被一些长的插入内含子序列分为若干短的外显子序列。目前的方法包括寻找ＨＩＦ岛、检测高度保守序列（ｚｏｏｂｌ...

利用外显子捕获技术从基因组片段中分离表达序列

本实验旨在以外显子捕获（ｅｘｏｎ－ｔｒａｐｐｉｎｇ）技术从人类５号染色体短臂（５ｐ）＂猫叫综合征＂区域分离表达序列。将来自５ｐ的基因组片段克隆进ｐＳＰＬ３剪接载体，用以转染ＣＯＳ－７细胞。经ＲＴ－ＰＣＲ扩增后，以ＵＤＧ法克隆剪接产物，并进行基因组来源、组织表达特异性及序列分析等鉴定。结果表明，基因组片段在实验系统中能被有效剪接，并得到了确为５ｐ来源的表达序列。证明外显子捕获技术能有效用于表达序列的筛选，但现有的剪接载体仍有较为严重的隐含剪接问题。

外显子捕获

外显子捕获张秀清宋莉杨焕明国际“人类基因组计划”的重要目标之一是鉴定与克隆基因，这就需要从庞大的基因组中确定哪些序列是与遗传性状相关的功能基因。“外显子捕获（ｅｘｏｎｔｒａｐｐｉｎｇ）”曾称ｅｘｏｎａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，是从基因组克隆片段中分离...

用新一代外显子捕获测序技术诊断眼皮肤白化病Ⅲ型一例

目的对一例疑为眼皮肤白化病的患儿进行临床和遗传学分析。方法对患儿进行临床检查，提取患儿及其父母基因组DNA，采用新一代外显子目标区域捕获测序技术对患儿进行基因突变分析，并对疑似致病性突变进行患儿及其父母的Sanger测序验证及生物信息学预测。结果患儿歪头视物，视力低下，伴有双眼水平冲动型眼球震颤，毛发棕黄色。基因测序显示患儿TYRP1基因存在c．1214C〉A（P．T405N）和c．1333dupG杂合突变，分别遗传自其母亲和父亲。生物信息学预测为致病性突变。结论患儿为Ty尺纠基因复合杂合突变引起的眼皮肤白化病Ⅲ型，TYRP1复合杂合突变致病的病例尚未见报道。

目标外显子组捕获测序发现INPP5E突变致Joubert综合征1例

目的:鉴定一个中国Joubert综合征家系的致病基因及位点。方法:对该Joubert综合征家系的先证者进行目标外显子组捕获测序,通过生物信息学分析找到候选的致病基因及位点,利用聚合酶链式反应(PCR)和Sanger测序进行验证。结果:在先证者的9号染色体INPP5E基因上存在2个杂合变异位点,分别为c.1524C>G,p.Asp508Glu以及c.1688G>A,p.Arg563His。这两个位点在家系中符合遗传共分离规律。结论:目标区域捕获测序结合Sanger测序发现INPP5E基因的c.1524C>G以及c.1688G>A位点为引起该Joubert综合征家系临床病变的变异位点,这是国内首次报道的由INPP5E基因突变导致的Joubert综合征病例,且c.1524C>G为首次发现的新致病位点。

高通量基因捕获测序技术在一遗传性耳聋大家系中的应用

目的分析一个常染色体显性遗传性非综合征耳聋大家系的临床特征,进行候选致病基因的突变筛查。方法对家系成员进行病史采集、全身检查、听力学评估及颞骨CT检查;抽提家系成员外周血基因组DNA;整理分析家系资料绘制系谱图;使用定向捕获联合二代测序技术,对包括所有已知非综合性耳聋的137个耳聋相关基因的外显子及其侧翼内含子序列进行筛查;对可疑基因进行Sanger测序验证。结果该家系共4代,现存家系成员28人,系谱分析符合常染色体显性遗传特征。参与本研究的耳聋患者9人,均为语后聋,均表现为迟发性、渐进性听力下降,发病年龄6~18岁,听力曲线多为平坦型。先证者(Ⅳ-4)检测结果经数据分析滤过后确定2个潜在基因致病突位点:MYH14,c.359C>T,p.S120L;COL11A2,c.4478G>A,p.R1493Q。后续经直接测序验证,在该家系中,只有MYH14,c.359C>T变异和家系的表型共分离,其余1个可疑突变位点在家系中无共分离现象。结论本研究鉴定了一个常染色体显性遗传性非综合征耳聋大家系的致病突变(MYH14,c.359C>T),同时证实高通量基因捕获测序技术是遗传性耳聋的一种行之有效的分子诊断工具。

染色体17p13.3肿瘤杂合性缺失区域内外显子的分离

目的 在染色体 17p13.3杂合性缺失区域内进行表达序列的分离。方法 采用外显子搏获法对位于 17p13.3杂合性缺失区域内的 BAC基因组克隆进行外显子的分离。结果 在获得的克隆中 ,4个克隆为已知基因的外显子 ,另 4个克隆属于 3个新外显子 (2个克隆中的外显子片段序列一致 )。结论 在染色体 17p13.3杂合性缺失区域内获得了一些表达序列。

人基因组中表达序列的分离

迅速分离和鉴定大片段基因组DNA中的表达序列,可加速人类疾病相关基因的克隆和人类基因转录图的构建.本文对几种常用的分离表达序列的方法,就其可行性、应用前景和面临的问题展开讨论.

复旦大学附属儿科医院高通量测序数据一体化全流程闭环分析系统及临床应用案例分析

背景目前的临床遗传诊断中,外显子组捕获测序(ES)和全基因组测序(WGS)均有广泛的应用场景且在综合性价比和变异检测范围等方面各有优势;建立支持两种不同建库策略测序方案的整合性遗传诊断流程,是进一步提高遗传诊断敏感性和检测效率的关键。目的整合ES以及WGS场景下的多变异类型分析、遗传病复杂临床表型的标准化与结构化、表型导向的遗传变异分析系统,建立从临床检测申请到遗传报告反馈的一体化流程。设计流程开发。方法(1)建立复旦大学附属儿科医院高通量测序数据一体化全流程闭环分析系统(复旦流程3.0)各个模块:①病史处理,②结构化遗传表型,③测序实验,④变异检测,⑤变异解读,⑥质控复核,⑦基因型表型联合分析。(2)代表性病例重测分析:根据结论性变异的类型和诊断难度选择代表性病例,展示代表性病例从病史处理开始到报告草稿为止各模块的运行情况。主要结局指标代表性病例分析过程中的结构化表型、数据质控、变异检测及解读、最终诊断。结果对3例代表性病例的重分析中,分别进行了经济版家系WGS、先证者WGS以及ES;病史成功提取结构化表型;FastQ及BAM文件结果数据质控良好;检测到的变异经解读之后进行基因型表型联合分析,分别检测出3例病例的复杂遗传模式。例1:ANTXR2基因点突变NM_058172:c.1294C>T与4q21.22约13 kb的结构变异缺失形成隐性纯合致病;例2:线粒体MT-ND6基因致病变异m.14459G>A,异质性>99.5%;例3:SMN1基因纯合致病变异NM_000344:c.863G>T合并SMN1基因单拷贝缺失。结论复旦流程3.0可整合ES和WGS数据,处理不同类型的变异结果,最终形成遗传诊断,且对复杂变异类型有高效处理能力。

ACSF3基因突变所致联合性丙二酸甲基丙二酸尿症一例

目的 探讨联合性丙二酸甲基丙二酸尿症(CMAMMA)的临床表型及基因变异特征。方法 提取本例CMAMMA患儿及其父母外周血DNA,进行高通量测序技术检测变异基因,再进行Sanger测序验证。结果 患儿男性,4个月7d,发病早期临床症状轻重,表现为视觉传导通路延迟和智力测试边缘化,尿液检查结果显示甲基丙二酸MMA明显升高,丙二酸MA未升高。基因检测显示本例患儿为ACSF3基因突变c.259delG(p.C88Vfs*30)和c.1456G>A(p.A486T)的复合杂合子,前者来自于父亲,后者来自于母亲,均为新突变,且国内未见报道。结论 ACSF3基因位点中c.259delG(p.C88Vfs*30)的移码突变和c.1456G>A(p.A486T)的错义突变是导致该患儿CMAMMA致病因素。

安捷伦科技新闻发布

安捷伦科技公司宣布：用于新一代DNA测序前靶向序列富集的SureSelect人类基因组全外显子捕获试剂盒，现在正式支持在Applied Biosystems的SOLiD平台上的应用。AppliedBiosystems是Life Technologies公司旗下的品牌。

一种结合单张芯片序列捕获和高通量测序技术测序外显子组的方法

随着高通量测序技术的发展,全外显子测序已经成为一种研究人类疾病的重要方法.本文展示了一种通过Nimblegen2.1M芯片进行外显子DNA序列捕获和高通量测序的方法,包括两步法文库制备.测序的平均覆盖深度达33倍时,95.6%的34M目标区域得到均衡覆盖,特异性达到80%.对比全基因组鸟枪法测序的结果,此方法在检测SNP时的假阳性率为0.97%,假阴性率为6.27%.本方法对于全基因组扩增的DNA也适用.结果显示,全外显子测序技术可以在大规模的群体研究和医学研究中起到重要作用.

高通量基因捕获测序技术在12个耳聋家庭中的应用

目的分析12个耳聋家庭的临床特征,进行候选致病基因的突变检测。方法对12个耳聋家庭的患者进行病史采集、全身检查、听力学评估及颞骨CT检查;抽提家庭成员外周血基因组DNA;整理分析家系资料绘制系谱图;使用定向捕获联合二代测序技术进行耳聋基因检测;对可疑基因进行Sanger测序验证。结果 12个耳聋家庭的13名耳聋患者表现为双侧不同程度的感音神经性耳聋。家庭1-7耳聋患者明确GJB2双等位基因突变致聋,分别是:c.235del C/c.235del C,c.235del C/c.176del16,c.235del C/c.299del AT,c.235del C/c.511_512ins AACG/c.235del C/c.605ins46,c.235del C/c.109G>A,c.109G>A/c.109G>A;家庭8-9先证者均为SLC26A4复合杂合突变致聋,分别是:c.589G>A/c.1975G>C,c.919-2A>G/c.-2071_307+3801del7666;其中,家庭10-12先证者,经过数据分析后分别得到8、5和3个可疑突变位点,在相应的家系中不与耳聋表型共分离,故未发现其致病基因。结论本研究明确了9个非综合征耳聋家庭的致病突变,同时证实高通量基因捕获测序技术是一种高效的耳聋基因检测工具。

外显子组重测序技术在筛选心血管疾病新致病基因中研究进展

外显子组是全部外显子区域的集合,外显子组捕获及下一代测序是一种新型基因组分析技术,是高效筛选新致病基因的方法之一。近年来应用该项技术已发现一系列疾病的新致病基因,目前也广泛用于肿瘤和罕见疾病及心血管疾病研究并取得一定进展。本文对该项技术在心血管系统疾病中的研究进展作一综述,旨在为心血管疾病病因和发病机制研究提供新的研究方法。

线粒体DNA耗竭综合征1例临床特点和DGUOK基因突变分析

该文报道1例线粒体DNA耗竭综合征患儿的临床特征及DGUOK基因突变特点。患儿女,婴儿期起病,表现为肝脾肿大、肝功能异常、眼球震颤和精神运动发育迟缓等。提取患儿及其父母外周血DNA标本,采用外显子组捕获测序技术检测致病突变,并对检测到的突变进行Sanger测序验证。结果显示患儿为DGUOK基因突变c.679G>A和c.817del T的复合杂合子,前一个突变来自于母亲,为已报道致病性突变;后者来自于父亲,是一个未见文献报道的新突变。该研究扩展了DGOUK基因突变谱,为患儿病因诊断及该家系的遗传咨询和产前诊断提供了分子依据。

一例进行性家族性肝内胆汁淤积症3型患儿的临床及遗传学分析

目的探讨1例遗传性胆汁淤积症患儿的临床及遗传学特点。方法收集患儿临床资料，采用外显子组捕获测序检测患儿的致病突变，并进行Sanger测序验证。结果患儿为一名5岁男孩，表现为严重胆汁淤积性肝硬化。基因分析结果显示患儿为ABCB4基因新突变c．1006-2A〉G和c．3580C〉T（p．R1194X）的复合杂合子，突变分别来源于其父母亲；蛋白结构预测分析显示突变c．3580C〉T导致截短型多药耐药蛋白3的形成。结论临床及基因分析明确患儿为进行性家族性肝内胆汁淤积症3型，扩展了ABCB4基因突变谱，为家系遗传咨询和产前诊断提供了依据。