白癜风外科治疗新进展——毛囊外根鞘细胞悬液移植

白癜风是一种皮肤色素异常性疾病,表现为慢性局限性的皮肤色素脱失斑,表皮黑素细胞功能进行性丢失,如果出现毛发变白则提示预后较差。白癜风的外科疗法即手术治疗,适用于对光疗或药物治疗无效的稳定期白癜风患者,对非手术疗法不敏感的皮损,如唇部、手足、手指及生殖器等部位也可采用外科疗法。除了常见的自体表皮移植和自体黑素细胞移植,近年来采用毛囊单位提取法获取毛囊外毛根鞘细胞悬液移植作为一种新的外科手段,逐渐显现出其在白癜风治疗中的优势。该文就该方法在白癜风中的应用作一综述。

内皮素-1对毛囊外根鞘无色素黑素细胞黏附和移行及其细胞骨架形态的影响

目的:体外研究内皮素-1(ET-1)对毛囊外根鞘无色素黑素细胞(AMMC)黏附和移行的作用,并观察其对细胞骨架蛋白微丝、微管的形态影响。方法:3种浓度的ET-1作用体外纯化培养的人AMMC,观察其在细胞外基质蛋白如纤维连接蛋白、层黏连蛋白、Ⅳ型胶原包被培养板上的黏附,以及通过Boyden小室微孔滤膜的情况。采用免疫荧光双重染色法对AMMC分别进行罗丹明(红色)和异硫氰酸(绿色)标记纤维型-肌动蛋白(F-actin)、β微管蛋白,激光共聚焦显微镜观察3种浓度ET-1处理前后AMMC纤维型-肌动蛋白、β微管蛋白形态的变化。结果:与空白对照组相比,ET-1促进了AMMC在纤维连接蛋白上的黏附,20ng/mLET-1作用最明显(P<0.01),而200ng/mL时对细胞的黏附不继续增加。但对层黏连蛋白和Ⅳ型胶原上的黏附无明显影响(P>0.05)。另外,ET-1呈浓度依赖性地促进AMMC通过微孔滤膜。激光共聚焦显微镜观察显示,>20ng/mLET-1可明显促进AMMC胞质中束状应力纤维形成,并集中分布于细胞膜内侧,但对微管结构无明显影响。结论:ET-1在体外可以促进AMMC的黏附和移行,其作用可能与诱导束状应力纤维形成和促进其向细胞膜内侧分布有关。

VEGF对体外培养绒山羊次级毛囊外根鞘细胞的影响

本研究旨在探讨陕北白绒山羊毛囊外根鞘细胞的培养和VEGF对次级毛囊外根鞘细胞增殖、分化及细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)、角蛋白10(K10)和成纤维细胞生长因子5(FGF5)mRNA表达量的影响。采集绒山羊体侧部皮肤,并利用消化等方法分离次级毛囊外根鞘细胞,置于37℃、5%CO_2、饱和湿度条件下培养;选用第5代次级毛囊外根鞘细胞,添加不同质量浓度血管内皮生长因子(VEGF),分别处理24、48h,噻唑兰比色法(MTT)检测细胞活力,EdU核酸标记技术检测细胞增殖;实时荧光定量PCR技术检测PCNA、K 10、FGF5mRNA的表达情况。结果显示:1)成功培养出次级毛囊外根鞘细胞,CK17和CK15细胞免疫组化呈阳性。2)VEGF可以促进绒山羊次级毛囊外根鞘细胞的增殖。相同浓度VEGF处理48h组的细胞活力极显著高于处理24h组(P<0.01);在48h处理组中,100ng·mL^(-1)组的细胞活力极显著高于对照组、1ng·mL^(-1)组、10ng·mL^(-1)组(P<0.01),并显著高于50ng·mL^(-1)组(P<0.05),50ng·mL^(-1)组的细胞活力显著高于对照组(P<0.05);100ng·mL^(-1)组和50ng·mL^(-1)组增殖细胞比例均极显著高于对照组、1ng·mL^(-1)组、10ng·mL^(-1)组(P<0.01),100ng·mL^(-1)组显著高于50ng·mL^(-1)组(P<0.05)。3)PCNA、K10、FGF5mRNA在次级毛囊外根鞘细胞中均有表达。在VEGF处理48h时,PCNA mRNA的表达量100ng·mL^(-1)组最高,极显著高于对照组(P<0.01),显著高于10ng·mL^(-1)组(P<0.05);K10mRNA的表达量对照组最高,极显著高于10ng·mL^(-1)组与100ng·mL^(-1)组(P<0.01);FGF5mRNA的表达量对照组最高,极显著高于100ng·mL^(-1)组(P<0.01)。综上表明,本研究成功分离培养了陕北白绒山羊次级毛囊外根鞘细胞;VEGF能够促进次级毛囊外根鞘细胞的增殖,抑制细胞的分化;VEGF可能通过抑制次级毛囊外根鞘细胞中FGF5基因的表达而促进毛囊生长。

人头皮毛囊外根鞘无色素黑素细胞的分离和纯化培养进一步研究

目的从人头皮毛囊外根鞘分离纯化培养无色素黑素细胞。方法采用两步酶法0.50%分离酶和0.50%胶原酶Ⅴ获得游离的毛囊,高浓度0.50%胰酶30min消化游离的毛囊外根鞘细胞,并以优化的培养基进行细胞培养。用HMB-45和NKI/beteb单克隆抗体免疫组化染色、透射电镜对培养物进行鉴定。结果培养物中初始贴壁细胞大多数为无色素黑素细胞,仅有少量的角质形成细胞,无成纤维细胞污染。经二次传代差别胰酶处理很容易去除角质形成细胞。取培养3周的细胞经免疫组化和透射电镜鉴定证实为无色素黑素细胞。传3代后细胞得到完全纯化。结论两步酶法结合高浓度的胰蛋白酶处理细胞可彻底清除成纤维细胞,获得无色素黑素细胞的纯培养。

308nm准分子激光联合胡椒碱对毛囊外根鞘无色素黑素细胞黑素合成及酪氨酸酶相关蛋白酶-1、-2蛋白表达的促进作用

目的研究308 nm激光联合胡椒碱对毛囊外根鞘无色素黑素细胞(AMMC)黑素合成及酪氨酸酶相关蛋白酶(TRP)-1、TRP-2蛋白表达的影响。方法体外培养的AMMC细胞分别以联合疗法组、308 nm激光组、胡椒碱组、阳性对照组及空白对照组作用24、72及120 h,测定黑素含量,激光共聚焦显微镜观察并定量分析荧光染色后细胞内TRP-1、TRP-2的表达情况。结果 4组均能促进AMMC细胞黑素量生成。联合治疗组、308 nm激光组、胡椒碱组、阳性对照组均不同程度的促进黑素含量的增加,其中以联合治疗组促进作用最强。胡椒碱呈浓度依赖性促进黑素合成且作用72 h时效果最明显。0.5 mmol/L胡椒碱作用72 h可促进表皮黑素细胞TRP-1表达,而对TRP-2的表达无明显影响。308 nm激光对TRP-1、TRP-2均有促进作用。结论 308 nm激光联合胡椒碱能促进AMMC细胞的黑素合成。

甲氧沙林对体外培养的人毛囊外根鞘无色素黑素细胞的激活作用

目的:观察甲氧沙林(8-MOP)对体外培养的人毛囊外根鞘无色素黑素细胞黑素合成相关酶的影响。方法:3种浓度(10、50、100μmol/L)的8-MOP作用于体外培养的人毛囊外根鞘无色素黑素细胞,经免疫荧光染色后,采用激光共聚焦显微镜观察不同浓度、不同作用时间的8-MOP对无色素黑素细胞形态的影响,荧光定量分析酪氨酸酶、酪氨酸相关蛋白(TRP)1、TRP2表达量的变化。结果:50、100μmol/L8-MOP作用于人毛囊外根鞘无色素黑素细胞3d能显著促进酪氨酸酶的表达(P<0.01)熏作用7d后TRP1、TRP2的表达也增加(P<0.05)。结论:8-MOP在体外能直接刺激毛囊外根鞘无色素黑素细胞的活化。

人毛囊外根鞘及毛乳头细胞的迁移和生长观察

目的连续观察成人头皮毛囊外根鞘(ORS)和毛乳头(DP)细胞的生长及形态学变化。方法利用两步酶消化获得正常人头皮毛囊的ORS和DP,采用添加HKGS和HMGS的K-SFM进行体外培养,倒置显微镜下连续观察毛囊ORS和DP的迁移和生长。结果将单个毛囊置于预先涂布血清的培养板2h,然后添加少量培养基,毛囊黏附于培养板的几率增加,数小时后,即可见细胞从ORS及DP处迁移生长,以角质形成细胞(KCs)、成纤维细胞(FBs)为主,黑素细胞(MCs)较少。并且,ORS和DP的迁出和生长有明显不同。如果培养基过多,则多数毛囊悬浮,无细胞迁出,最终死亡。结论预先涂布血清和开始仅添加少量培养基,有利于毛囊黏附,随后细胞迁移生长。

人毛囊外根鞘隆起、真皮鞘和毛乳头细胞高效同步分离培养的方法

目的寻求一种快速高效同步分离培养人头皮毛囊外根鞘隆起（Bulge）细胞、真皮鞘细胞和毛乳头细胞的方法。方法将人头皮标本剪成小块,中性蛋白酶中37℃孵育2h后镜下将带外根鞘的毛干从真皮鞘中拔出,组织块法培养外根鞘隆起（Bulge）细胞;从真皮-皮下组织交界处横断头皮,拔出含毛乳头的真皮鞘,胶原酶D37℃孵育6-8h,多次低速离心,毛乳头沉淀重悬后培养,收集的真皮鞘细胞上清液经高速离心后重悬培养;培养的细胞分别用K19或α-平滑肌动蛋白组化鉴定。结果同一标本可获得纯化的外根鞘Bulge细胞,真皮鞘细胞和毛乳头细胞。结论将现有的分离方法改进和综合运用,可以从同一毛囊标本同步高效获取3种成分细胞。

人毛囊外根鞘细胞的分离及培养

目的建立毛囊外根鞘细胞的分离和培养方法。方法利用中性蛋白酶分离得到单个毛囊,采用组织块法和消化法进行细胞培养,倒置显微镜、扫描及透射电镜观察细胞形态,培养各代细胞做生长曲线,RT-PCR检测干细胞相对特异性标识分子K15和细胞分化标识分子外皮蛋白的mRNA表达情况。结果组织块法和消化法均能培养出毛囊外根鞘细胞,并可传代培养,组织块法细胞生长慢,不易汇合,消化法细胞增殖快。各代细胞中K15和外皮蛋白mRNA均有表达。结论消化法适合毛囊外根鞘细胞的体外培养,该方法的建立为进一步分离纯化培养毛囊干细胞奠定了基础。

尿激酶型纤溶酶原激活物对毛囊外根鞘细胞增殖的影响

目的 探讨尿激酶型纤溶酶原激活物 (Urokinase typeplasminogenactivator,uPA)对体外培养的毛囊外根鞘 (Outerrootsheath ,ORS)细胞增殖的作用。方法 体外培养了小鼠ORS细胞 ;用MTT法研究了uPA促进因子肝细胞生长因子 (Hepatocytegrowthfactor ,HGF)和uPA抑制因子Amiloride处理后ORS细胞的增殖变化 ;用RT PCR方法研究了ORS细胞的uPAmRNA的表达情况 ,以及HGF和Amiloride处理ORS细胞后uPA的mRNA表达的变化。结果 体外培养的ORS细胞有uPA表达 ;HGF可促进uPAmRNA的表达并促进ORS细胞的增殖 ;Amiloride抑制uPAmRNA表达并抑制ORS细胞增殖。结论 毛囊ORS细胞表达uPA ,HGF促进uPA的表达并促进ORS细胞增殖 ,Amiloride通过抑制uPA的表达和其活性抑制ORS细胞的增殖。

皮肤组织工程中毛囊外根鞘细胞增殖能力及细胞角蛋白表达的意义

目的:通过培养人毛囊外根鞘细胞群,观察其增殖活性及细胞角蛋白K19的表达。方法:利用人头皮拔出的毛发,以组织块法和酶消化法培养毛囊外根鞘细胞,用四氮噻唑蓝(MTT)法比较其与表皮角质形成细胞的增殖能力,用免疫组化检测培养外根鞘细胞中细胞角蛋白K19的表达。结果:外根鞘细胞具有较表皮角质形成细胞更强的增殖能力,而且在培养的外根鞘细胞中有大量细胞角蛋白K19阳性的细胞。结论:由于外根鞘细胞具有较表皮角质形成细胞更强的增殖能力,同时含有大量K19阳性细胞,可以作为皮肤组织工程种子细胞来源。

毛囊外根鞘NKI/beteb和HMB-45免疫组化及胰酶消化后细胞的电镜观察

目的:研究头皮毛囊外根鞘中无活性黑素细胞的存在部位以及毛囊经胰酶消化的细胞组成。方法:拔取正常头发,琼脂预先包埋后,切片行NKI/beteb和HMB-45单抗染色。另取毛囊用胰酶消化,收集细胞,在透射镜下进行观察。结果:拔取的正常毛囊外根鞘中存在NKI/beteb阳性细胞,而HMB-45染色阴性。在毛母质中有大量的HMB-45阳性细胞。毛囊经胰酶消化的细胞为有活性的黑素细胞(MC)、无色素性黑素细胞(AMMC)、毛皮质细胞和成纤维细胞。结论:毛囊外根鞘中存在功能和形态不成熟的AMMC。

308 nm激光联合胡椒碱对毛囊外根鞘无色素黑素细胞黏附、移行及酪氨酸酶相关蛋白表达的影响

目的:研究308 nm准分子激光(EL)联合胡椒碱对毛囊外根鞘无色素黑素细胞(AMMC)黏附、移行及酪氨酸酶相关蛋白(TRP-1及TRP-2)表达的影响,初步探讨其对AMMC黑素合成影响的作用机制。方法:体外培养的AMMC分别予308nm EL(激光组)、胡椒碱(胡椒碱组)及二者联合(联合干预组)作用72 h、120 h及168 h,同时设阳性对照组及空白对照组。激光共聚焦显微镜观察AMMC黏附及移行情况,并定量分析荧光染色后AMMC细胞内TRP-1及TRP-2表达。结果:与空白对照组比较,其余4组均能不同程度地促进AMMC的黏附及移行。联合干预组、激光组及阳性对照组TRP-1及TRP-2表达均上调,其中联合干预组促进作用最强。胡椒碱作用72 h可促进AMMC细胞内TRP-1表达,且呈浓度依赖性;而对TRP-2的表达无影响。结论:308 nm EL联合胡椒碱具有促进AMMC黏附、移行及提高细胞内TRP-1及TRP-2表达的作用。

人外根鞘细胞体外培养及其增殖或抑制情况下米诺地尔浓度的选择

目的:观察钾通道开放剂米诺地尔在不同浓度下对体外培养人外根鞘细胞增殖活性的影响。方法:实验于2005-04/11在解放军第四军医大学西京医院烧伤实验室完成。①实验材料:所有毛囊标本均来自解放军第四军医大学西京医院美容整形术后,供体为健康成年男性,年龄28～49岁,局部头皮无秃发、感染及其他皮肤疾病,均对本实验知情同意。以同一供体的毛囊标本为一个批次,至少取3批以上标本进行培养。米诺地尔(Sigma公司,美国,批号M20001001)。②实验方法:将头皮剪成0.3～0.5cm宽的皮条,再将真皮层剪去少许,消毒后以Dispase酶消化过夜,16～18h后揭去头皮表皮,拔出毛囊,使用无血清DMEM培养基清洗分离的毛囊。将毛囊置于胰酶+乙二胺四乙酸中消化8min,血清中止消化后离心,再加无血清DMEM培养基洗涤,然后置于预先铺Ⅰ型胶原作基质的角质形成细胞无血清培养基中培养,至外根鞘细胞长出并接近融合时按1∶传代。电子天平称取米诺地尔21mg,加入角质形成细胞无血清培养基20mL溶解,用稀释法分别配制成30,0.01,0.05,0.1,0.5,1.0mmol/L6个梯度浓度。③实验评估:取第2代外根鞘细胞,胰酶消化后计数,用相应培养基稀释成2×107L-1的细胞悬液,接种于96孔板。1d后细胞贴壁生长,分别换用含有0,0.01,0.05,0.1,0.5,1.0mmol/L的米诺地尔培养基,第4天加入四氮噻唑蓝在酶联免疫检测仪上检测吸光度值。结果:0,0.01,0.05,0.1,0.5,1.0mmol/L米诺地尔吸光度值分别为0.501±0.019,0.774±0.038,0.819±0.040,0.418±0.040,0.329±0.026,0.220±0.031。结论:①角质形成细胞无血清培养基有助于人外根鞘细胞的生长和传代,是较合适的培养基。②0.01～0.05mmol/L米诺地尔能够促进外根鞘细胞的增殖,而0.1mmol/L以上浓度反而抑制其生长。

雄激素与体外培养的人毛乳头细胞和外根鞘细胞相互作用的研究

目的观察不同浓度雄激素(睾酮)对体外培养人毛乳头细胞和外根鞘细胞增殖活性的影响。方法采用脱发和非脱发成人头皮标本,用胶原酶消化法分离毛乳头,在角质形成细胞无血清培养基上,对其进行体外培养。采用非脱发成人头皮标本,组织法培养毛囊外根鞘细胞。然后将不同浓度睾酮加入两种毛乳头细胞与外根鞘细胞的共同培养基中,比较其对外根鞘细胞的增殖活性的影响。结果不同浓度睾酮对单独培养的两种毛乳头细胞和外根鞘细胞的增殖性均无作用(与对照组相比P>0.05)。10-9ml/L浓度(与对照组相比P<0.05)、10-8ml/L浓度、10-7ml/L浓度(与对照组相比P<0.01)睾酮与非脱发患者的毛乳头细胞共同培养时,可促进外根鞘细胞增殖。而10-10ml/L浓度(与对照组相比P<0.05)、10-9ml/L浓度、10-8ml/L浓度、10-7ml/L浓度(与对照组相比P<0.01)睾酮与脱发患者的毛乳头细胞共同培养时,对外根鞘细胞出现增殖抑制作用。结论睾酮对外根鞘细胞的影响,与其剂量和毛乳头细胞的存在有关。在这个过程中,毛乳头细胞可能起介导作用。

小鼠触须毛囊外根鞘细胞的体外培养及uPA和uPAR表达研究

目的 建立小鼠毛囊外根鞘细胞的体外培养方法及研究尿激酶型纤溶酶原激活剂及其受体 (uPA uPAR)的表达。方法 建立以毛囊真皮鞘细胞为滋养层 ,培养外根鞘细胞并对uPA uPAR的表达进行免疫细胞化学鉴定。结果 外根鞘细胞在此滋养层上生长较好 ,并有uPA uPAR的表达。结论 毛囊真皮鞘细胞是外根鞘细胞较好的滋养层 。

BMP-4对人毛囊外根鞘细胞增殖和迁移的影响

目的观察BMP-4对体外培养的人毛囊外根鞘细胞增殖和迁移的影响。方法用含不同浓度BMP-4的MSCM培养基培养毛囊外根鞘细胞48小时后行MTT检测毛乳头细胞的增殖情况;将铺满90%培养皿底的毛囊外根鞘细胞划痕后以含不同浓度BMP-4的MSCM培养基培养,分别于0h,8h,24h和48h测量毛囊外根鞘细胞爬行的距离。结果与其他浓度相比,10μg/mlBMP-4明显促进毛囊外根鞘细胞的增殖(P<0.05),不同浓度BMP-4均促进毛囊外根鞘细胞的迁移,48小时10μg/ml浓度BMP-4的创面愈合指数达到100%(P<0.05)。结论 BMP-4对于毛囊形成及发育具有重要意义。

山羊毛囊外根鞘细胞系的建立

本试验旨在建立纯一、稳定的山羊毛囊外根鞘细胞系。活体采集济宁青山羊羔羊背部皮肤,采用机械分离与酶消化相结合的方法,分离外根鞘细胞,培养于含有表皮生长因子（EGF）、类胰岛素生长因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）和氢化可的松的无血清角质细胞培养液中,置5%CO2浓度的37℃培养箱中启动原代培养。待原代细胞长成良好的单层后即可进行传代培养,细胞经传代培养至第8-10代时,更换含EGF、IGF-Ⅰ、氢化可的松和FBS的DMEM/F12培养液进行长期培养。选取传至第40代的外根鞘细胞进行生长特性研究与染色体分析。结果表明：体外培养的细胞倍增时间为51.9 h,培养细胞的染色体数仍以2n=60为主,但是出现了非整倍体性染色体特征;免疫细胞化学鉴定结果表明,该细胞系角蛋白19表达呈阳性。结果提示,本试验分离培养的细胞确为由山羊毛囊干细胞分化来的外根鞘细胞,体外培养的山羊毛囊外根鞘细胞系得到了成功建立。

毛囊外根鞘细胞的分离培养及鉴定

目的建立毛囊隆突处外根鞘细胞的分离和培养方法。方法利用中性蛋白酶分离得到单个毛囊,采用胰酶消化法进行细胞培养,倒置6显微镜观察细胞形态,绘制细胞生长增殖曲线,免疫荧光检测干细胞相对特异性标识分子角蛋白19(K19)和β1整合素表达情况,分别用分离培养的角质形成细胞(Keratinocytes,KCs)做对照。结果免疫荧光检测显示90%左右的毛囊外根鞘细胞胞浆中均有K19和β1整合素的阳性表达。结论应用中性蛋白酶和胰酶消化法体外培养毛囊隆突处外根鞘细胞简单、可行。

小鼠触须毛囊外根鞘再生的体外培养液优化及α-SMA的表达鉴定

【目的】为建立小鼠毛囊体外培养模型,筛选适合小鼠触须毛囊外根鞘离体培养的培养液,并进行α-SMA(α-平滑肌肌动蛋白)表达的免疫荧光鉴定。【方法】选择出生5 d内的乳鼠断颈法处死,利用显微解剖技术,分离触须毛囊外根鞘。并分别培养于无血清、含5%FCS、10%FCS的DMEM、MEM共计6种不同培养液中,在37℃,5%CO2培养箱中培养4 d后,制作冰冻切片并进行H.E.染色,在显微镜下观察乳鼠触须毛囊外根鞘的再生情况,筛选培养液。在最适培养液中培养乳鼠触须毛囊外根鞘,利用α-SMA抗体进行乳鼠触须毛囊外根鞘再生部位α-SMA表达的荧光鉴定。【结果】观察到小鼠触须毛囊外根鞘中段再生的初期结构特征,并且5%FCS MEM培养液是最适合小鼠触须毛囊外根鞘的体外培养液,免疫荧光检测发现α-SMA在毛囊外根鞘再生部位有表达。【结论】5%FCS MEM培养液是比较适合小鼠触须毛囊外根鞘的体外培养液,α-SMA的表达可以作为毛囊再生的检测指标之一。