绿脓杆菌ATCC27853外毒素PE40基因的扩增与测序

目的扩增绿脓杆菌ATCC27853外毒素基因PE40,并对PCR产物进行测序鉴定,为获得用于构建分子导向药物的毒素弹头基因PE40奠定基础。方法采用PCR技术,以绿脓杆菌ATCC27853基因组DNA为模板,扩增PE40基因并测序。用DNASTAR软件将测得的序列与GenBank中的国际标准产毒株PA103的PE40基因序列进行比较。结果扩增出目的基因片断,长度为1231bp。测序表明,ATCC27853与PA103核苷酸同源性为98%,产生了7个碱基的突变,突变碱基导致第364位的天冬酰胺变成丝氨酸,第506位的丝氨酸变成色氨酸,第515位的丝氨酸变成甘氨酸。但产生变化的3个氨基酸均不是文献报道中的重要活性位点。结论产生变化的3个氨基酸不会对PEA的酶活性及细胞毒性产生很大影响,绿脓杆菌ATCC27853的PE40基因可用作分子导向药物的弹头。

绿脓杆菌ATCC9027外毒素PE40基因克隆与系统发育分析

目的为获得用于构建免疫毒素弹头的毒素蛋白基因,克隆绿脓杆菌外毒素PE40基因。方法 PCR扩增ATCC9027外毒素PE40基因,纯化PCR产物与T载体连接后转染感受态大肠杆菌JM109,蓝白斑筛选阳性克隆,HindⅢ酶切和测序鉴定阳性克隆。将ATCC9027的PE40基因进行blast搜索,以Genbank中所有的绿脓杆菌外毒素PE40基因为内群,以白喉毒素基因为外群进行系统发育分析。结果 PCR产物为1 098 bp。与PA103相比,ATCC9027外毒素PE40基因有14个碱基的突变,导致外毒素蛋白8个氨基酸的突变。系统发育树显示绿脓杆菌外毒素PE40基因形成单系群,ATCC9027和ATCC927853的亲缘关系最近。结论 ATCC9027外毒素关键位点的氨基酸未发生突变,获得了用于构建免疫毒素弹头的毒素蛋白基因PE40。

绿脓杆菌外毒素A受体结合亚单位基因的克隆与表达

为防治绿脓杆菌感染造成的细胞坏死及多器官衰竭，本试验克隆了含绿脓杆菌外毒素Ａ（ＰＥＡ）结合亚单位（Ⅰ区）和部分跨膜亚单位（Ⅱ区）编码３０９个氨基酸的约１０００ｂｐ的基因片段，以正确阅读框架将该片段置于原核高效表达Ｔ７启动子下游，构建了高效表达质粒ｐＥＴ－ＥＡＢ。转化宿主菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＨＭ１７４（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ和ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ后，经ＩＰＴＧ诱导４ｈ，均表达了外源目的基因蛋白，其中ＢＬ２１（ＤＥ３）和ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ的表达量明显高于其他宿主菌。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，外源蛋白分子量约３４０００，与ＰＥＡⅠ区和部分Ⅱ区基因所编码的蛋白理论估计值相符，命名为ＰＥ３４。凝胶薄层扫描显示，ＰＥ３４含量占菌体蛋白总量的５６％。

假单孢杆菌外毒素基因的克隆及用于裸鼠大肠癌基因治疗

目的：建立假单孢杆菌外毒素Ａ（ＰＥＡ）基因的组织特异性抗大肠癌基因疗法。方法：用ＰＣＲ法从绿脓杆菌基因组ＤＮＡ中克隆ＰＥＡⅡ＋Ⅲ区基因，引入Ｋｏｚａｋ序列、终止信号和酶切位点，测序。构建ＰＥＡ基因转录受人癌胚抗原（ＣＥＡ）启动子调控的逆转录病毒载体。共转染法体外研究ＰＥＡ基因表达对报告基因表达的特异抑制作用。用ＤＮＡ体内直接转染法于裸鼠体内观察ＰＥＡ基因的抗人类肿瘤作用。结果：所克隆的ＰＥＡ序列与已报道序列基本相同。ＣＥＡ启动子调控的ＰＥＡ基因可在大肠癌细胞中特异性抑制荧光素酶基因表达，在裸鼠体内对人大肠癌模型的直接转染能特异抑制人大肠肿瘤的生长。结论：ＰＥＡⅡ＋Ⅲ区基因作为治疗基因。

铜绿假单胞菌外毒素A全长基因的扩增与克隆

目的 从绿脓杆菌中提取染色体DNA ,PCR扩增及克隆外毒素A全长基因 ,为实现外毒素A的高效表达奠定基础。方法 从绿脓杆菌培养物中提取染色体DNA ,PCR扩增外毒素A全长基因 ,A -T克隆入本室自行构建的pSK -T载体中 ,对重组质粒进行酶切与测序鉴定。结果与结论 成功地从高GC含量的绿脓杆菌染色体DNA中扩增到长片段的外毒素A全基因并进行了克隆与鉴定。

铜绿假单胞菌外毒素A表达载体的构建及可溶性表达

目的 实现铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)全基因的可溶性表达。方法 用基因重组技术构建pMAL PEA原核分泌型表达载体 ,并在大肠杆菌BL2 1中进行表达 ,然后利用直链淀粉树脂对表达蛋白进行亲和层析纯化。结果 酶切鉴定及测序结果表明pMAL P2X载体上成功地插入了PEA全基因。用IPTG诱导目的基因表达 ,表达的融合蛋白量约占细菌总蛋白的 2 0 %。表达产物经超声处理后 ,80 %的融合蛋白存在于上清液中 ,说明实现了PEA的可溶性表达。表达的融合蛋白经亲和层析纯化后进行SDS PAGE电泳 ,显示为一条蛋白带 ,分子量约为 112kD。结论 成功地对PEA全基因进行了可溶性表达和纯化 ,获得了稳定表达的工程菌 ,为深入研究PEA的致病机制和制备用于免疫导向治疗的重组毒素奠定了基础。

绿脓杆菌外毒素A抗原的制备与纯化

目的：制备绿脓杆菌外毒素Ａ（ＰＥＡ）抗原。方法：用胰酶酪蛋白大豆肉汤（Ｔｒｙｐｔｉｃｓｏｙｂｒｏｔｈ，ＴＳＢ），于３２℃水浴１２０次／ｍｉｎ振荡培养绿脓杆菌ＰＡ１０３株，其培养物经７０００ｒ／ｍｉｎ离心，取上清用７０％饱和硫酸铵沉淀，ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００柱层析，ＤＥＡＥ－５２（ＤＥ－５２）柱层析，羟基磷灰石柱层析制备ＰＥＡ。结果：纯化的ＰＥＡ经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）为一条带，分子量为Ｍｒ（６６～６８）×１０３ｕ。环状沉淀试验，琼脂双向扩散试验，酶联免疫吸附试验和免疫印迹分析表明本室纯化的ＰＥＡ，抗原性和分子量均与文献报道一致。结论：用本方法制备ＰＥＡ，避免了对ＤＥ－５２的反复再生，缩短了实验流程，对保持ＰＥＡ的生物活性有利。

海水养殖真鲷弧菌病病原菌外毒素的分离、纯化及生物学活性

1996年 6月初 ,对福建省平潭县真鲷网箱养殖场发生的弧菌病进行研究 ,并确定该病病原菌为最小弧菌 (Vibrio mimicus)。采用硫酸铵沉淀、DEAE-纤维素层析及 Sephadex-G1 0 0层析等方法对最小弧菌产生的外毒素进行研究。结果表明 ,该外毒素为单一的多肽 ,分子量为 3 0 .45 6 k D,对真鲷的 L D50 为 4.48μg,对真鲷等养殖动物的溶血性最强 ,对 Vero细胞的 CD50 值为 0 .48μg,肠毒性弱阳性。该外毒素与最小弧菌产生的其他毒力因子相比 ,性质独特 ,是一类新的毒力因子 ,建议命名为 Vm-

产气荚膜梭菌外毒素基因与相关疫苗的研究进展

产气荚膜梭菌也称魏氏梭菌,是引起气性坏疽、肠毒血症、出血性肠炎等反刍动物疾病的主要病原。该菌能够分泌α、β、ε、ι、γ、η、θ、κ、λ、μ、ν等多种外毒素,其中a、β、ε、ι毒素是主要的致病因子。产气荚膜梭菌引起的疾病通常发病急、死亡快,因此,疫苗免疫是预防该病的主要方法。近年来,随着对a、β、ε等毒素功能研究的深入,研究毒素相关的基因工程亚单位疫苗成为研究热点,并且有望弥补传统类毒素疫苗的安全性不高、稳定性差等缺点。文章从产气荚膜梭菌的病原学特点、主要外毒素的致病机制以及毒素相关疫苗的研究进展进行综述,以期为产气荚膜梭菌的综合防控和基因工程亚单位疫苗与核酸疫苗的研发提供一定的参考。

金黄色葡萄球菌外毒素及荚膜特异性卵黄抗体联合治疗奶牛乳房炎效果研究

本研究目的是评价金黄色葡萄球菌外毒素特异性卵黄抗体(IgY-toxins)及5、8、336型金黄色葡萄球菌荚膜特异性卵黄抗体(IgY-T5、IgY-T8及IgY-T336)联合使用对奶牛乳房炎的治疗效果。乳酸脱氢酶试验表明,IgYtoxins能够有效中和外毒素对乳腺上皮细胞MAC-T的破坏作用。荧光显微镜观察发现,5mg·mL-1的IgYT336可有效阻断金黄色葡萄球菌RN6390对MAC-T的侵袭。与单独使用IgY-T336相比,5mg·mL-1的IgYT336和0.5mg·mL-1的IgY-toxins联合使用能够更加有效地保护MAC-T细胞,同时显著改善细胞的生长形态。临床型乳房炎试验表明,与PBS对照相比,对金黄色葡萄球菌感染乳池每天注射各20mg的IgY-T5、IgY-T8、IgYT336及IgY-toxins可显著降低(P<0.001)病牛乳汁的体细胞数(SCC),20mg的IgY-T5、IgY-T8、IgY-T336或者20mg的IgY-toxins虽然也可降低体细胞数,但是降低幅度显著低于联合治疗组(P<0.01)。所有治疗组奶牛乳汁的凝块水平都显著低于对照组(P<0.05)。本研究表明,荚膜及外毒素特异性卵黄抗体联合使用比其单独使用对乳房炎的治疗效果更好,在应用卵黄抗体治疗乳房炎时应该将荚膜和外毒素都列为抗体的靶点。

苏云金杆菌B24-14及其β-外毒素对植物寄生线虫的作用

分离戈壁土壤样品 ,获得 1株芽孢杆菌菌株B2 4 14 ,经 16SrDNA序列分析鉴定为苏云金杆菌 (Bacillusthuringiensis)。用乙醇分级沉淀和紫外扫描方法 ,提取B2 4 14菌株的 β 外毒素。用细胞培养板法检测其对松材线虫 (Bursaphelenchusxylophilus)的毒杀效果 ,结果表明 :在 4mg·mL-1质量浓度下处理 8h ,线虫的杀死率可以达到93 75 % ,致死中质量浓度为 5 74 μg·mL-1;随处理时间延长和外毒素质量浓度的提高 ,毒杀效果也明显增强 ;6种质量浓度的 β 外毒素处理线虫 ,其死亡率与毒素质量浓度的自然对数呈正相关 ,相关系数为 0 981。温室防病试验表明 ,B2 4 14菌株的液体菌剂可以有效地防治根结线虫 (Meloidogynespp .) ,处理 2 1d黄瓜苗根结减退率达到71 6 %～ 84 6 % ,经多次试验其防治效果均与对照呈显著差异。

含绿脓杆菌外毒素A受体结合区重组蛋白的纯化

将表达含绿脓杆菌外毒素（ＰＥＡ）受体结合区基因的质粒ｐＥＴ－ＥＡＢ转化到大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中，经ＩＰＴＧ诱导表达了含ＰＥＡ受体结合区的重组蛋白（称ＰＥ３４）。ＰＥ３４主要以包涵体形式存在于大肠杆菌中，用溶菌酶－脱氧胆酸钠法结合超声波裂解法破碎细菌，离心制备包涵体。用２ｍｏｌ／Ｌ脲洗涤包涵体后，包涵体纯度可达７５％，在８ｍｏｌ／Ｌ脲存在条件下，ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－２００凝胶滤过，ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ离子交换层析纯化，获得ＳＤＳ－ＰＡＧＥ１条带的ＰＥ３４，纯度达９５．８％，得率为２４．５％。

白细胞介素2-绿脓杆菌外毒素融合基因的克隆及高效表达

利用聚合酶链式反应和寡核苷酸介导的定向诱变技术构建了白细胞介素2-绿脓杆菌外毒素IL2-PE40、IL2-PE40KDEL、IL2-PE66^(4Glu)和IL2-PE66^(4Glu)KDEL融合基因的原核表达重组质粒,并实现了高效表达,表达产物占菌体总可溶蛋白的20％～30％。此外,由于这一表达质粒在IL-2cDNA与PE基因连接处引入了唯一的SmaⅠ位点,其5＇、3＇端分别含有唯一的EcoRⅠ、PstⅠ位点,因此可方便地用其它基因替换IL-2或PE基因而获得相应融合蛋白的表达质粒。

36株气单胞菌外毒素溶血性和致病性的测定

应用溶血试验和动物试验检测 36株气单胞菌外毒素的溶血性和致病性。结果显示其中 30株细菌 (1 3株嗜水气单胞菌 ,1 7株温和气单胞菌 )产生的外毒素有溶血性。溶血价在菌株间差异较大 (1 2～ 1 1 2 8)。毒素的溶血价与对实验动物的致死率有明显相关性 ,溶血价在 1 1 6以上的外毒素对小鼠的致死率均为 1 0 0 % ,溶血价在 1 8以下的外毒素对小鼠的致死率在 0 %～ 1 0 0 %。此外 ,两株温和气单胞菌 (BA8和XA1 1 )培养物无菌上清液无溶血性 ,但对小鼠的致死率达 6 6 .6 % ,可能与细菌产生了胞外蛋白酶有关。

重组人白细胞介素2-绿脓杆菌外毒素融合蛋白的纯化及复性

目的探讨该所发明的新方法对重组人白细胞介素2-绿脓杆菌外毒素(IL2-PE664Glu)融合蛋白进行纯化与复性的效果。方法采用该所发明的新方法提纯包涵体,包涵体复性后,样品经DEAE-SepharoseFF离子交换层析,获得融合蛋白纯品。结果获得的具有生物学活性的融合蛋白纯度达到95%,复性回收率为80%。结论此包涵体分离纯化技术简便、实用,可为中试研究和规模化生产提供基础。

绿脓杆菌PA-SD-1株外毒素AⅢ区基因的克隆及序列分析

利用PCR技术 ,以绿脓杆菌羊分离株 (暂命名为PA_SD_1株 )的染色体DNA为模板 ,成功扩增出了该菌的主要致病基因 (绿脓杆菌外毒素A)Ⅲ区基因。将该PCR扩增片段与pGEMR_TEasy载体连接 ,获得了含有目的片段的重组质粒 (命名为PA_SD_ETA)。序列测定结果表明。该菌株与其他已报道的绿脓杆菌菌株有较高的同源性 ,而局部出现单个碱基的点突变。

绿脓杆菌外毒素A对兔角膜基质细胞的毒性作用

目的:探讨绿脓杆菌外毒素A兔对角膜基质细胞的毒性作用。方法:含兔角膜基质细胞(1×105.mL-1)三维胶原凝胶表面添加提纯的不同浓度绿脓杆菌外毒素A(0.1、1.0和10 mg.L-1)后,放入无血清MEM培养液中37℃培养24 h,采用光学显微镜观察培养的兔角膜基质细胞形态学变化,采用酶联免疫吸附法检测损伤的兔角膜基质细胞释放的乳酸脱氢酶(LDH)含量。结果:添加不同浓度绿脓杆菌外毒素A(0.1、1.0和10 mg.L-1)各组兔角膜基质细胞释放的LDH,与不添加绿脓杆菌外毒素A组比较,差异均有显著性(P<0.01)。添加不同浓度绿脓杆菌外毒素A各组较不添加绿脓杆菌外毒素A组,角膜基质细胞形态发生变化,细胞由长纺锤形变为圆形,细胞伪足减少。结论:绿脓杆菌外毒素A,破坏角膜基质细胞,对兔角膜基质细胞毒性作用有剂量依赖性。

重组绿脓杆菌外毒素A受体结合区蛋白的初步复性及细胞生物学活性检测

用逐步稀释透析法将纯化的大肠杆菌表达的重组绿脓杆菌外毒素Ａ（ＰＥＡ）受体结合区蛋白初步复性，复性后的可溶性蛋白用于竞争抑制ＰＥＡ的细胞毒性实验。将１０μｇ／Ｌ的ＰＥＡ与其敏感细胞Ｌ９２９共孵育，３６ｈ左右可见细胞发生病变死亡，而同时加入复性的重组ＰＥＡ受体结合区蛋白的培养细胞孔与未加ＰＥＡ阴性对照培养细胞一样仍分裂增殖，这种ＰＥＡ细胞毒性抑制作用可持续到所有培养细胞老化死亡。结果表明，重组ＰＥＡ受体结合区蛋白可在体外竞争抑制ＰＥＡ对Ｌ９２９细胞的毒性。

铜绿假单胞菌外毒素A的生产、分离纯化和鉴定

通过对培养基组成、种子活化、接种量和培养条件进行优化 ,使铜绿假单胞菌外毒素A(PE)产量达到每毫升 5～ 10 μg和 192小鼠LD50 ,不低于国外报道水平。经二步纯化 ,PE蛋白回收率为33.33% (PE)和 16.67% (LD50 ) ,提纯系数为 4 38.5 (PE)或 2 18.5 (LD50 ) ,SDS PAGE呈现一条带 ,相对分子质量为 660 0 0 ,琼脂糖扩散鉴定与兔抗PE产生一条沉淀线 ,小鼠半数致死量为 0 .16μg ,PE对小鼠成纤维母细胞L92 9有毒性作用 ,能被兔抗PE血清所中和。