食管鳞状细胞癌外泌体miR-181b-5p通过靶向抑制PTEN促进肿瘤相关巨噬细胞极化

目的:探究食管鳞状细胞癌外泌体miR-181b-5p对M2型巨噬细胞极化的影响及机制。方法:提取并鉴定食管鳞状细胞癌外泌体,qRT-PCR检测miR-181b-5p在食管鳞状癌细胞及其外泌体中的表达。M0型巨噬细胞分为PBS组、HEEC exo组、Eca-109 exo组、miR-NC exo组、miR-181b-5p exo组、miR-NC组、miR-181b-5p mimic组、si-NC组、si-PTEN组、miR-181b-5p exo+PTEN组,qRT-PCR检测各组细胞中CD163、CD206、iNOS、TNF-α表达。双荧光素酶报告基因实验验证miR-181b-5p和PTEN的靶向关系。结果:miR-181b-5p在食管鳞状癌细胞TE-13、TE-12、TE-10、Eca-109、KYSE30及其外泌体中显著高表达(P<0.001)。相比于miR-NC组,miR-181b-5p mimic组细胞CD163和CD206表达显著上调(P<0.001),iNOS和TNF-α表达显著下调(P<0.001)。双荧光素酶报告基因结果显示PTEN为miR-181b-5p的靶基因。相比于si-NC组,si-PTEN组细胞CD163和CD206表达显著上调(P<0.001),iNOS和TNF-α表达显著下调(P<0.001)。相比于PBS组,Eca-109 exo组细胞CD163和CD206表达显著上调(P<0.001),而iNOS和TNF-α表达显著下调(P<0.001)。相比于miR-NC exo组,miR-181b-5p exo组细胞CD163和CD206表达显著上调(P<0.001),而iNOS和TNF-α表达显著下调(P<0.001)。相比于miR-181b-5p exo组,miR-181b-5p exo+PTEN组CD163和CD206表达显著下调(P<0.001),而iNOS和TNF-α表达显著上调(P<0.001)。结论:外泌体miR-181b-5p抑制PTEN表达而促进M2型巨噬细胞极化。

高、低表达miR-296-5p的肿瘤细胞外泌体对食管鳞癌细胞迁移和侵袭的调控作用

目的探讨高、低表达miR-296-5p的肿瘤细胞外泌体对食管鳞癌细胞(ESCC)迁移和侵袭的调控作用及其机制。方法提取转染miR-296-5p过表达和miR-296-5p干扰及其阴性对照物(NC)后的ESCC细胞外泌体,并采用透射电镜与Western blotting法进行鉴定;将ESCC细胞分为三组,干扰组、过表达组分别加入miR-296-5p干扰或过表达细胞的外泌体培养,NC组加入NC转染细胞的外泌体培养48 h;取各组细胞,MTT法检测细胞活力、Transwell法检测细胞侵袭迁移能力,RT-PCR、Western blotting法检测细胞黏附分子3(CADM3)、CADM1、CADM4、钙黏蛋白E(E-cadherin)及血管内皮细胞生成浸润相关蛋白CD31、CD44。结果细胞活力、迁移和侵袭细胞数过表达组>NC组>干扰组(P均<0.05)。细胞中CADM1、CADM4、E-cadherin基因及蛋白表达水平干扰组>NC组>过表达组,CADM3、CD31、CD44基因及蛋白表达水平过表达组>NC组>干扰组(P均<0.05)。结论高表达miR-296-5p的肿瘤细胞外泌体可能通过调控CADM、E-cadherin、CD31、CD44等基因表达提高ESCC细胞的侵袭、迁移能力。

脓毒症外泌体miR-1306-5p对肠黏膜上皮细胞炎症、凋亡和氧化应激的影响

目的研究脓毒症血浆源性外泌体微小RNA-1306-5p(miR-1306-5p)对肠黏膜上皮细胞的炎症、凋亡和氧化应激损伤的调控作用,并探讨潜在机制。方法分离脓毒症血浆源性外泌体和健康血浆外泌体,分为健康血浆外泌体组和脓毒症血浆源性外泌体组。用电镜观察外泌体,分析两组外泌体物理参数,并检测外泌体中miR-1306-5p的表达。将肠黏膜上皮细胞分为对照组、miR-1306-5p模拟物的阴性对照组(mimic-NC组)、miR-1306-5p模拟物组(mimic组)、mimic联合过表达Polo样激酶1(PLK1)的空载体组(mimic-PLK1-EV组)、mimic联合过表达PLK1组(mimic+PLK1-OE组)。采用实时荧光定量PCR检测各组中miR-1306-5p和PLK1 mRNA的表达,蛋白质印记法检测miR-1306-5p的靶基因PLK1、胱天蛋白酶(caspase)3、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl2-相关X蛋白(Bax)的表达,双荧光素酶报告基因法检测miR-1306-5p和PLK1的结合作用,采用流式细胞术检测细胞凋亡,酶联免疫吸附试验检测培养细胞的上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8的表达,试剂盒法检测细胞中活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)及超氧化物歧化酶(SOD)的表达。结果脓毒症血浆源性外泌体和健康血浆外泌体均呈椭球形,物理参数之间的差异无统计学意义(P>0.05),与健康血浆外泌体组比较,脓毒症血浆源性外泌体组中的miR-1306-5p的表达上调(P<0.05)。双荧光素酶报告基因法证实,PLK1是miR-1306-5p的靶基因。与mimic-NC组比较,mimic组miR-1306-5p、TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β、caspase3、Bax、ROS、MDA的表达上调,细胞凋亡率增加,PKL1、Bcl-2、GSH、SOD的表达下调,差异均有统计学意义(P<0.05)。与mimic+PLK1-EV组比较,mimic+PLK1-OE组TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β、caspase3、Bax、ROS、MDA的表达明显下调,细胞凋亡率降低,PKL1、Bcl-2、GSH、SOD的表达上调,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论脓毒症血浆源性外泌体miR-1306-5p通过靶向抑制PKL1促进肠黏膜上皮细胞的炎症、凋亡和氧化应激损伤。

miR-141-5p/ZNF705A对慢性粒细胞白血病细胞源外泌体调控骨髓间充质干细胞黏附作用的机制

目的探讨慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)细胞源外泌体(exosome,Exo)中miR-141-5p/ZNF705A对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)黏附作用的影响。方法电镜和NTA粒径分析检测CML患者外周血和K562细胞中的Exo形态大小;qRT-PCR和Western blot检测转染前后K562细胞的Exo、BMSCs标记分子及黏附蛋白的表达情况;细胞黏附实验检测BMSCs的黏附能力;CCK-8法检测BMSCs活性、萤光素酶实验检测miR-141-5p与ZNF705A结合情况等。结果qRT-PCR结果显示,miR-141-5p表达在CML患者和K562细胞源Exo中均明显降低;qRT-PCR和Western blot等结果表明,CML患者中BMSCs的黏附蛋白CD44和CXCL12表达明显降低,且能够吞噬K562细胞源Exo。进一步发现,与CD34^(+)细胞相比,K562源性Exo能够降低Exo促进的BMSCs中CD44和CXCL12表达和黏附作用;同时,双萤光素酶基因报告等验证miR-141-5p与ZNF705A靶向结合;最后发现通过上调K562细胞源Exo中miR-141-5p的表达,靶向抑制ZNF705A,进而促进BMSCs的活性和黏附功能。结论K562细胞下调Exo中miR-141-5p表达,减少对ZNF705A的靶向抑制,进而抑制BMSCs的黏附功能,从而调控CML患者的骨髓造血功能。

miR-146a-5p miR-155-5p在寻常型银屑病不同体液外泌体中的表达

目的 探讨外泌体miR-146a-5p、miR-155-5p在寻常型银屑病患者血浆、唾液、尿液中的表达及意义。方法 采用超速离心法提取40例寻常型银屑病患者血浆、唾液和尿液中外泌体,利用投射电镜观察外泌体形态,并提取RNA,利用核酸测定仪检测RNA浓度,RT-qPCR检测miR-146a-5p、miR-155-5p的表达水平。结果 外泌体外形呈现圆形或椭圆形,直径均在60~200 nm;外泌体RNA在银屑病患者血浆、唾液、尿液中的浓度分别为3.9 ng/μl、61.6 ng/μl、0.57 ng/μl;外泌体miR-146a-5p、miR-155-5p在寻常型银屑病患者血浆、唾液、尿液中的表达分别为血浆(0.01±0.002)、(0.06±0.002),尿液(1.03±0.02)、(0.95±0.08),唾液(0.02±0.00)、(0.18±0.01)。结论 外泌体miR-146a-5p、miR-155-5p在寻常型银屑病患者不同体液中存在表达性差异,从微观角度研究银屑病,有利于为今后的诊断、治疗及发病机制的研究提供科研依据。

miR-192-5p及TAMs源性外泌体对人子宫内膜癌细胞裸小鼠成瘤性的影响

目的探究miR-192-5p及肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs)源性外泌体对人子宫内膜癌(endometrial cancer,EC)细胞增殖及成瘤性的影响。方法采用TAMs、阴性模拟物NC转染的TAMs以及miR-192-5p转染的TAMs源性外泌体刺激子宫内膜癌细胞,并分别注入裸小鼠体内,进行肿瘤细胞移植瘤实验。然后测量各组移植瘤的体积,分别采用RT-PCR和Western blot检测肿瘤组织内miR-192-5p、相关激酶(IRAK1)和下游核因子-κB(NF-κB)表达情况,评估上调miR-192-5p的表达水平对EC细胞增殖及IRAK1和NF-κB表达水平的影响。结果TAMs源性外泌体促进肿瘤生长,miR-192-5p过表达可明显缩小肿瘤体积;miR-192-5p过表达抑制了肿瘤组织中IRAK1和NF-κB的表达。结论上调TAMs中的miR-192-5p的表达水平可能通过IRA K1和NF-κB信号通路抑制EC细胞的增殖及成瘤性。

过表达miR-486-5p的骨髓间充质干细胞通过外泌体来保护缺氧损伤心肌细胞

目的探讨过表达miR-486-5p小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)来源外泌体(Exo)对缺氧损伤心肌细胞的影响及机制。方法通过慢病毒转染来构建过表达miR-486-5p的小鼠BMSC。提取转染成功的BMSC所分泌的Exo,包括空载体BMSC分泌的Exo(Exo-NC)、miR-486-5p过表达BMSC分泌的Exo(Exo-miR-486)及未处理BMSC分泌的Exo(Exo-Control)。取12~18 d胎鼠原代心肌细胞,将其分为常氧培养组(Normoxia组)、缺氧培养组(Hypoxia组)、Hypoxia+Exo-NC组及Hypoxia+Exo-miR-486组,并给予不同时间的缺氧处理来模拟心肌细胞缺氧状态,检测细胞增殖状态、凋亡率,以及活性氧(ROS)、核苷酸结合结构域富含亮氨酸重复序列和含热蛋白结构域受体3(NLRP3)和裂解的胱天蛋白酶-1(cleaved caspase-1)的表达水平。结果Hypoxia组心肌细胞增殖能力低于Normoxia组,而凋亡率及ROS、NLRP3和cleaved caspase-1的表达水平均高于Normoxia组(P<0.05);Hypoxia+Exo-NC组心肌细胞增殖能力高于Hypoxia组,凋亡率及ROS、NLRP3和cleaved caspase-1的表达水平低于Hypoxia组(P<0.05);Hypoxia+Exo-miR-486组心肌细胞增殖能力高于Hypoxia+Exo-NC组,凋亡率及ROS、NLRP3和cleaved caspase-1表达水平低于Hypoxia+Exo-NC组(P<0.05)。结论来自miR-486-5p过表达BMSC的Exo能减少缺氧导致的ROS的产生及其引起的心肌细胞凋亡,并改善缺氧引起的心肌细胞增殖缓慢的问题。

哮喘儿童血清外泌体中miR-7-5p表达水平与短期预后的相关性研究

目的 分析哮喘儿童血清外泌体中微小RNA(microRNA,miR)-7-5p表达水平与短期预后的关系。方法 选取2021年10月~2023年5月唐山职业技术学院附属医院的132例哮喘儿童(哮喘组)和30例健康儿童(对照组)作为研究对象。根据儿童哮喘控制测试结果将哮喘儿童分为预后不良组(n=41)和预后良好组(n=91)。比较各组的过敏史、用力肺活量(forced vital capacity,FVC)、呼出气一氧化氮(fractional exhaled nitric oxide,FeNO)和血清外泌体miR-7-5p等水平。用Logistic回归分析哮喘儿童短期预后的风险因素。用Kappa检验、受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线和平均绝对误差(mean absolute error,MAE)值评价各指标判断哮喘儿童短期预后的价值。结果 哮喘组血清外泌体miR-7-5p[0.53(0.49,0.64)]水平低于对照组[1.03(0.97,1.10)],差异具有统计学意义(χ^(2)/Z=8.548,P <0.001)。预后不良组的过敏史占比(68.29%)和FeNO[38(36,41)ppb]水平高于预后良好组[46.15%,35(30,40)ppb],FVC[1.86(1.84,2.05)L]和miR-7-5p[0.47(0.43,0.52)]水平低于预后良好组[1.94(1.87,2.06)L,0.60(0.50,0.68)],差异具有统计学意义(χ2/Z=2.854~6.450,均P <0.05)。多因素Logistic回归分析结果显示,过敏史(OR=3.388,95%CI:1.328~8.643)和高FeNO(OR=1.161,95%CI:1.064~1.267)水平是哮喘儿童短期预后的独立危险因素(P <0.01),高miR-7-5p(OR=0.090,95%CI:0.033~0.248)水平是哮喘儿童短期预后的独立保护因素(P <0.01)。miR-7-5p+过敏史+FeNO判断哮喘儿童短期预后的ROC曲线下面积为0.904,大于miR-7-5p(0.851,Z=2.097,P=0.036)和过敏史+FeNO(0.726,Z=4.239,P <0.001)。miR-7-5p+过敏史+FeNO的Kappa值为0.67,大于mi R-7-5p(0.44)和过敏史+FeNO(0.41);MAE值为0.022,小于miR-7-5p(0.067)和过敏史+FeNO(0.035)。结论 哮喘儿童血清外泌体中miR-7-5p表达水平高与其短期预后良好有关。miR-7-5p,过敏史和FeNO联合对哮喘儿童短期预后评估有一定价值。

间充质干细胞来源的外泌体miR-3614-5p通过抑制铁死亡改善模型大鼠先兆子痫进展的机制研究

目的研究间充质干细胞来源外泌体微小核糖核酸-3614-5p(miR-3614-5p)对模型大鼠先兆子痫(preeclampsia,PE)进展的调节作用及相关机制。方法将36只SD大鼠(24只雌性和12只雄性)以雌雄比例2∶1合笼饲养自然受孕。24只妊娠大鼠随机分为假手术组(sham组)、PE模型组(PE组)和外泌体miR-3614-5p组(PE+exo组),每组8只。PE组通过皮下注射100 mg/kg的NG-硝基-L-精氨酸甲酯建立大鼠PE模型;PE+exo组构建PE模型,同时在第14天腹腔注射160μg/ml的外泌体悬液(0.5 ml/只/天),连续6天,实验持续21天;sham组则给予等量生理盐水。在妊娠第0,7,14和21天测量血压和尿蛋白浓度。RT-qPCR检测miR-3614-5p水平及B细胞淋巴瘤病-2(Bcl-2)、Bcl相关X蛋白(Bax)的mRNA水平;ELISA检测Caspase-3活性、活性氧(ROS)水平及丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)和亚铁离子(Fe2+)含量;Western blot检测谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)和溶质载体家族7成员11(SLC7A11)蛋白水平。结果与sham组大鼠相比,PE组大鼠的胎盘组织(0.43±0.05 vs 1.01±0.07)和外周血(0.51±0.07vs 1.01±0.12)中miR-3614-5p表达显著下调,差异具有统计学意义(t=19.070,10.180,均P<0.01)。与上清液相比,源自MSCs的外泌体中miR-3614-5p显著富集。与sham组相比,PE组大鼠第21天的舒张压(175.43±6.02 mmHg vs113.26±5.11 mmHg)、收缩压(123.57±5.63 mmHg vs 82.63±5.26 mmHg)及尿蛋白含量(175.48±13.21 mg/ml vs67.65±5.76 mg/ml)显著升高(t=22.606,16.440,23.168,均P<0.01);与PE组相比,PE+exo组舒张压(124.57±5.33mmHg vs 175.43±6.02 mmHg)、收缩压(89.76±3.88 mmHg vs 123.57±5.63 mmHg)及尿蛋白含量(97.69±7.23 mg/ml vs 175.48±13.21 mg/ml)显著降低,差异具有统计学意义(t=18.493,13.577,16.713,均P<0.01)。与sham组相比,PE组大鼠胎盘组织中Caspase-3活性(238.56%±13.22%vs 100.12%±5.93%)、Bax水平(3.18±0.71 vs 1.01±0.11)、ROS水平(387.65%±25.98%vs 100.51%±5.89%)、MDA含量(33.21±3.17 nmol/mg vs 14.83±2.69 nmol/mg)和Fe2+浓度(38.77±6.53 nmol/ml vs 17.51±3.15 nmol/ml)显著升高,而Bcl-2水平(0.47±0.08 vs 1.01±0.12)、GSH含量(4.12±1.22 nmol/mg vs 9.76±0.93 nmol/mg)、GPX4蛋白(0.48±0.06 vs 1.01±0.24)和SLC7A11蛋白(0.51±0.11vs 1.01±0.11)水平则显著降低(t=6.459~32.863,均P<0.01);与PE组相比,PE+exo组胎盘组织中Caspase-3活性(117.35%±8.67%vs 238.56%±13.22%)、Bax水平(1.13±0.45 vs 3.18±0.71)、ROS水平(128.73%±14.37%vs387.65%±25.98%)、MDA含量(18.13±3.89 nmol/mg vs 33.21±3.17 nmol/mg)和Fe2+浓度(19.05±3.45 nmol/ml vs38.77±6.53 nmol/ml)显著降低,而Bcl-2水平(1.04±0.11 vs 0.47±0.08),GSH含量(7.86±1.07 nmol/mg vs 4.12±1.22nmol/mg),GPX4蛋白(0.98±0.14 vs 0.48±0.06)和SLC7A11蛋白(1.11±0.09 vs 0.51±0.11)水平则显著升高,差异具有统计学意义(t=6.093~29.633,均P<0.01)。结论miR-3614-5p在PE模型大鼠的胎盘组织和外周血中显著下调。MSCs来源的外泌体miR-3614-5p通过抑制铁死亡改善大鼠的PE进展。MSCs来源的外泌体miR-3614-5p可能是PE治疗的一个新的潜在的生物标志物。

血清外泌体miR-181c-5p和miR-142-5p对非小细胞肺癌的诊断价值

目的探讨血清外泌体miR-181c-5p和miR-142-5p在非小细胞肺癌诊断中的价值。方法前瞻性选取NSCLC患者65例作为研究对象,为NSCLC组;另选取同期体检健康者60例为健康组。收集NSCLC患者的一般资料,包括年龄、性别、病理类型、肿瘤直径、TNM分期、淋巴结转移、分化程度、浸润程度等。NSCLC患者治疗前、健康组体检时抽取空腹静脉血,血清中提取外泌体,RT-PCR法检测外泌体的miR-181c-5p和miR-142-5p的表达。结果NSCLC组血清中miR-181c-5p和miR-142-5p的表达明显低于健康组(t=7.358、8.613,P<0.001)。NSCLC患者miR-181c-5p和miR-142-5p表达与年龄、性别、病理类型、肿瘤直径无关(P>0.05),与TNM分期、淋巴结转移、分化程度、浸润程度相关(P<0.05)。miR-181c-5p曲线下面积AUC为0.862(95%CI:0.799~0.925,P<0.001),当截断值为0.673时,灵敏度为81.54%,特异度为71.67%;miR-142-5p曲线下面积AUC为0.878(95%CI:0.819~0.936,P<0.001),当截断值为0.752时,灵敏度为84.62%,特异度为72.30%;miR-181c-5p和miR-142-5p联合诊断的曲线下面积AUC为0.912(95%CI:0.863~0.961,P<0.001),灵敏度为86.15%,特异度为78.33%。结论miR-181c-5p和miR-142-5p在NSCLC患者血清中低表达,其有望成为临床NSCLC辅助诊断的分子标志物。

宫颈癌源外泌体miR-191-5p通过靶向TJP1调控血管内皮细胞层通透性促癌细胞转移的分子机制研究

目的探讨宫颈癌细胞分泌的外泌体miR-191-5p对血管内皮细胞层的通透性影响,为肿瘤血管相关的基因靶点研究提供理论依据。方法提取并鉴定宫颈癌细胞(SiHa/HeLa)培养上清来源的外泌体。将宫颈癌细胞源外泌体与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)共培养,检测外泌体的摄取。跨内皮电阻(TEER)测定HUVEC单层细胞形成时间。内皮细胞层通透性测定HUVEC细胞层通透性。qRT-PCR检测宫颈癌细胞、外泌体及与外泌体共培养48 h的HUVEC中miR-191-5p表达。双荧光素酶报告基因实验检测miR-191-5p与TJP1的靶向关系。qRT-PCR、Western blot检测miR-191-5p、TJP1表达。内皮细胞层穿透实验检测miR-191-5p对HUVEC细胞层通透性的影响以及能否促进宫颈癌转移。恢复实验、qRT-PCR、Western blot检测TJP1的表达。结果提取的微小囊泡确是宫颈癌源外泌体。宫颈癌源外泌体可被HUVEC细胞摄取。TEER随时间增加而增大,在培养3 d时细胞形成单层,TEER达到最大值;外泌体共培养的HUVEC细胞层通透性增大,差异有统计学意义(P<0.0001)。miR-191-5p在宫颈癌源外泌体中富集,并被转运至HUVEC细胞中,miR-191-5p与TJP1存在靶向关系。与PBS组比较,miR-191-5p mimics组的miR-191-5p相对表达水平升高,TJP1的相对表达水平下降,而miR-191-5p inhibitor组的miR-191-5p相对表达水平下降,TJP1的相对表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.01);与PBS组比较,miR-191-5p mimics组通透性增加,而miR-191-5p inhibitor组通透性减弱,差异有统计学意义(P<0.0001)。在SiHa细胞中,与PBS组比较,miR-191-5p mimics组穿透的平均细胞数增加,miR-191-5p inhibitor组穿透的平均细胞数下降,差异有统计学意义(P<0.05)。在HeLa细胞中,与PBS组比较,miR-191-5p mimics组穿透的平均细胞数增加,miR-191-5p inhibitor组穿透的平均细胞数下降,差异有统计学意义(P<0.05)。恢复实验结果显示,与PBS组比较,miR-191-5p mimics组TJP1的相对表达量下降,差异有统计学意义(P<0.05);与miR-191-5p mimics组比较,pCMV-T+mimics组中TJP1的表达量增加,差异有统计学意义(P<0.01)。结论宫颈癌源外泌体miR-191-5p通过靶向调控TJP1导致血管内皮细胞层通透性增加,进而促进宫颈癌细胞转移。

幽门螺杆菌诱导的胃癌细胞源性外泌体miR-382-5p通过靶向PTEN抑制巨噬细胞自噬并促进其M2极化

目的:探讨幽门螺杆菌(H.pylori)诱导的人胃癌细胞源性外泌体miR-382-5p对巨噬细胞自噬和极化的影响及机制,为进一步阐明H.pylori的致癌机制提供新线索。方法:超高速离心法和试剂盒提取H.pylori刺激组和对照组AGS细胞释放的外泌体,采用透射电镜(TEM)、纳米粒子跟踪分析(NTA)和Western blot对外泌体进行鉴定;qRT-PCR检测H.pylori诱导的胃癌细胞AGS源性外泌体中miR-382-5p表达;将miR-382-5p mimic转染至THP-1巨噬细胞,Western blot检测巨噬细胞自噬标志物LC3Ⅱ、P62、Beclin-1的表达,免疫荧光检测自噬小体数量;Western blot检测PTEN蛋白、其下游蛋白PI3K、AKT、mTOR及其磷酸化蛋白p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表达水平;流式细胞术检测巨噬细胞表型分子CD206和HLA-DR表达水平;ELISA检测巨噬细胞上清中细胞因子TNF-α、IL-6、IL-10和精氨酸酶1表达水平。结果:提取的外泌体符合外泌体形态,且高表达其表面标志蛋白CD9、CD63、TSG101;与空白对照组相比,H.pylori感染组AGS源性外泌体中miR-382-5p表达显著升高;miR-382-5p mimic转染导致巨噬细胞LC3、Beclin-1表达降低,P62表达升高,自噬小体数量降低;PTEN蛋白表达降低,p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表达明显增加。转染同时导致巨噬细胞M2型标志蛋白CD206表达增加,M1型标志蛋白HLA-DR表达降低;IL-10和精氨酸酶1表达增加,IL-6和TNF-α表达降低。抑制剂BEZ235预处理可部分逆转miR-382-5p对巨噬细胞自噬和极化的影响。结论:H.pylori诱导的胃癌细胞源性外泌体miR-382-5p通过靶向PTEN基因,激活PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制巨噬细胞自噬并促进其M2极化。

支气管哮喘患儿血清外泌体miR-93-5p检测的价值

目的探讨支气管哮喘患儿血清外泌体微小RNA-93-5p(miR-93-5p)水平检测的价值,及其与气道炎症和肺功能的相关性。方法选取2020年4月—2022年4月内江市第二人民医院支气管哮喘患儿133例(哮喘组)和体检健康儿童133名(正常对照组)。根据支气管哮喘病情将133例患儿分为急性发作期组(51例)和临床缓解期组(82例)。检测所有研究对象血清外泌体miR-93-5p相对表达量、气道炎症指标[血清IgE、白细胞介素(IL)-17、嗜酸性粒细胞绝对数(EO#)、C反应蛋白(CRP)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-8]和肺功能[用力肺活量(FVC%)、一秒用力呼气容积(FEV1%)、FEV1占FVC的百分比(FEV1/FVC%)]。采用Pearson相关分析评估各项指标的相关性。采用受试者工作特征(ROC)曲线评价各项指标诊断支气管哮喘患儿急性发作的效能。结果与正常对照组比较,哮喘组血清外泌体miR-93-5p和IgE、IL-17、EO#、CRP、TNF-α、IL-8均升高(P<0.001),FVC%、FEV1%和FEV1/FVC%均降低(P<0.001)。Pearson相关分析结果显示,哮喘组血清外泌体miR-93-5p与IgE、IL-17、EO#、CRP、IL-8均呈正相关(r值分别为0.319、0.440、0.535、0.279、0.296,P<0.05),与FEV1%、FVC%、FEV1/FVC%均呈负相关(r值分别为-0.304、-0.295、-0.327,P<0.05)。与临床缓解期组比较,急性发作期组血清外泌体miR-93-5p相对表达量降低(P<0.001),IgE、IL-17、EO#、CRP、IL-8水平升高(P<0.01)。ROC曲线分析结果显示,血清外泌体miR-93-5p、IgE、IL-17、EO#、CRP、TNF-α、IL-8诊断支气管哮喘急性发作的曲线下面积(AUC)分别为0.88、0.60、0.65、0.64、0.69、0.62、0.66。结论支气管哮喘患儿血清外泌体miR-93-5p水平显著升高,且与患儿肺功能、气道炎症密切相关,或可作为支气管哮喘病情评估的指标。

胎盘源性外泌体miR-122-5p改善妊娠糖尿病脐静脉内皮细胞功能损伤的机制研究

目的探讨胎盘源性外泌体(Exo)miR-122-5p改善妊娠糖尿病(GDM)小鼠脐静脉内皮细胞(MUVECs)功能损伤的机制。方法取妊娠小鼠腹腔注射0.25%链脲佐菌素溶液以诱导GDM模型(GDM组),对照组小鼠腹腔注射等体积0.9%氯化钠溶液,检测两组FPG和胰岛素水平验证模型。采用HE染色观察小鼠胎盘组织形态,qRT-PCR法检测miR-122-5p表达情况,Western blot法检测核苷酸结合结构域富含亮氨酸重复序列和含热蛋白结构域受体3(NLRP3)炎症小体相关蛋白[包括NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白、半胱氨酸蛋白酶-1]表达。采用差速离心法获得胎盘源性Exo,并采用透射电子显微镜和纳米颗粒追踪分子对Exo表征进行鉴定;与MUVECs共培养后,采用免疫荧光法观察MUVECs对Exo的摄取。采用噻唑蓝法、流式细胞术、Transwell实验和血管形成实验检测MUVECs细胞活性、凋亡能力、迁移能力和成管能力。结果GDM组小鼠FPG水平明显高于对照组(P<0.001),胰岛素水平低于对照组(P<0.001),提示模型构建成功。与对照组相比,GDM组小鼠胎盘组织出现明显损伤,miR-122-5p表达水平降低,NLRP3炎症小体相关蛋白表达水平均明显升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。MUVECs能对胎盘源性Exo进行摄取,且GDM小鼠胎盘Exo上调了MUVECs中miR-122-5p表达水平(P<0.001)。GDM小鼠胎盘Exo共培养的MUVECs较对照小鼠胎盘Exo共培养的MUVECs细胞活性增强,凋亡能力减弱,迁移能力和成管能力均增强,且NLRP3炎症小体相关蛋白表达水平均明显下降,差异均有统计学意义(均P<0.05)。过表达miR-122-5p的MUVECs细胞活性增强,凋亡能力减弱,迁移能力和成管能力均增强,NLRP3炎症小体相关蛋白表达水平降低,差异均有统计学意义(均P<0.05);抑制miR-122-5p表达后,MUVECs细胞活性减弱,凋亡能力增强,迁移能力和成管能力均减弱,NLRP3炎症小体相关蛋白表达水平均明显升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论胎盘源性Exo的miR-122-5p对GDM MUVECs起到保护作用,且可能通过调控NLRP3炎症小体的活化来改善MUVECs的损伤。

宫颈癌患者血清外泌体miR-185-5p表达水平变化及临床应用价值

目的:探究宫颈癌患者血清微小RNA-185-5p表达水平及临床应用价值。方法:选取113例宫颈癌患者(宫颈癌组)、101例宫颈上皮内瘤变(CIN)患者(CIN组)和95例健康体检女性(健康对照组),采用实时荧光定量PCR法检测三组血清外泌体miR-185-5p的表达水平,比较各组血清外泌体miR-185-5p水平差异,并探讨其与宫颈癌患者临床病理特征的关系。采用Cox回归模型对血清外泌体miR-185-5p水平及临床病理资料进行多因素分析。采用受试者工作特征(ROC)曲线评估血清外泌体miR-185-5p对宫颈癌的诊断价值。结果:与健康对照组比较,宫颈癌组和CIN组患者血清外泌体miR-185-5p表达水平显著降低(P<0.01),且宫颈癌组更低于CIN组(P<0.01)。在FIGO分期Ⅲ、Ⅳ期、有淋巴结转移和有阴道壁累及的宫颈癌患者其血清外泌体miR-185-5p水平分别显著低于FIGO分期Ⅰ、Ⅱ期、无淋巴结转移和无阴道壁累及的患者(P<0.05或P<0.01)。血清外泌体miR-185-5p的水平(HR=0.260,P<0.01)与淋巴结转移(HR=1.572,P<0.05)是宫颈癌患者预后的独立影响因素。血清外泌体miR-185-5p鉴别宫颈癌的ROC曲线下面积为0.796,敏感度为67.26%,特异度为81.05%。结论:血清外泌体miR-185-5p水平有助于宫颈癌的临床诊断和早期预后评估。

外泌体miR-155-5p在癌细胞增殖和侵袭中作用的研究进展

外泌体miR-155-5p作为广泛存在于多种细胞类型中的微小RNA,在调控基因表达、细胞增殖、分化、凋亡等方面发挥重要作用。研究表明,外泌体miR-155-5p在多种癌细胞中高表达,并与癌细胞增殖、侵袭、转移等恶性行为密切相关。因此,研究外泌体miR-155-5p在癌细胞增殖、侵袭中的作用具有重要意义和应用价值。本综述旨在通过对外泌体及miR-155-5p进行概述,并详细分析外泌体miR-155-5p在癌细胞增殖、侵袭中的机制,同时探讨其在不同类型癌症中的具体作用,以及评估其作为生物标志物和治疗靶点的潜力,以期为进一步理解外泌体miR-155-5p在癌细胞中的作用机制及临床应用提供理论基础和研究思路。

外泌体微小RNA-877-5p通过调控Nrf2/HO-1轴诱导铁死亡对肝癌细胞的影响

目的分析外泌体微小RNA-877-5p(miR-877-5p)通过调控转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2)/血红素加氧酶1(HO-1)轴诱导铁死亡对肝癌细胞增殖、凋亡的影响。方法检测正常肝细胞与肝癌细胞株中miR-877-5p表达量,并对MHCC97H细胞进行转染,分为空白组、miR-877-5p抑制剂组、miR-877-5p模拟物组,检测各组铁死亡相关因子Nrf2、HO-1表达量,观察并分析各组MHCC97H细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡情况。结果与正常肝细胞L02相比,肝癌细胞株中HEP3B、HCCLM3、HepG2、MHCC97H mRNA表达量降低(P<0.05);与肝癌细胞HEP3B、HCCLM3、HepG2相比,肝癌细胞MHCC97H mRNA表达量降低(P<0.05);与空白组相比,miR-877-5p抑制剂组miR-877-5p mRNA表达量、细胞凋亡率降低(P<0.05),溶质载体家族7成员11(SLC7A11)和谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的表达量、增殖活性、迁移细胞数、侵袭细胞数及Nrf2、HO-1表达量升高(P<0.05),miR-877-5p模拟物组miR-877-5p mRNA表达量、细胞凋亡率升高(P<0.05),SLC7A11、GPX4的表达量、增殖活性、迁移细胞数、侵袭细胞数及Nrf2、HO-1表达量降低(P<0.05);与miR-877-5p抑制剂组相比,miR-877-5p模拟物组miR-877-5p mRNA表达量、细胞凋亡率升高(P<0.05),SLC7A11、GPX4的表达量、增殖活性、迁移细胞数、侵袭细胞数及Nrf2、HO-1的表达量降低(P<0.05)。结论上调外泌体miR-877-5p可抑制Nrf2/HO-1轴的激活,促使铁死亡,抑制肝癌细胞增殖,加快癌细胞的凋亡速度。

胸腔积液外泌体miR-506-3p联合腺苷脱氨酶检测在结核性胸膜炎的早期诊断及预后评估中的价值

目的 分析胸腔积液外泌体miR-506-3p联合腺苷脱氨酶(adenosine deaminase,ADA)在结核性胸膜炎的早期诊断及预后评估中的价值。方法 选取2021年8月至2023年3月就诊于沧州市人民医院的90例结核性胸膜炎患者作为结核组,另选同期于沧州市人民医院就诊的50例非结核性胸膜炎(肺炎旁胸腔积液、恶性胸腔积液等)患者作为非结核组,对比两组临床资料与胸腔积液外泌体miR-506-3p、ADA水平,经多因素Logistic回归分析影响结核性胸膜炎发生的危险因素。根据治疗3个月后患者预后情况,将结核组分为预后良好组(72例)、预后不良组(18例),对比两组胸腔积液外泌体miR-506-3p、ADA水平。经Pearson相关性分析,并绘制受试者操作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC曲线),分析胸腔积液外泌体miR-506-3p、ADA水平及二者联合预测结核性胸膜炎发生及患者预后的价值。结果 结核组患者胸腔积液ADA水平比非结核组高,胸腔积液外泌体miR-506-3p水平比非结核组低(P<0.05);经多因素Logistic回归分析发现,胸腔积液ADA水平高[OR=1.205(95%CI 1.105~1.313)]是结核性胸膜炎发生的危险因素(P<0.05),外泌体miR-506-3p水平高表达[OR=0.320(95%CI 0.158~0.658)]是结核性胸膜炎发生的保护因素(P<0.05);预后不良组患者胸腔积液ADA水平比预后良好组高,胸腔积液外泌体miR-506-3p水平比预后良好组低(P<0.05);绘制ROC曲线发现,胸腔积液ADA、外泌体miR-506-3p水平及二者联合预测结核性胸膜炎发生的曲线下面积(area under curve,AUC)为0.729(95%CI 0.640~0.818)、0.810(95%CI 0.738~0.883)、0.874(95%CI 0.818~0.930),预测结核性胸膜炎患者不良预后的AUC为0.892(95%CI 0.806~0.978)、0.924(95%CI 0.868~0.981)、0.942(95%CI 0.875~1.000);Pearson相关性显示,胸腔积液ADA与外泌体miR-506-3p水平呈负相关(r=-0.335,P=0.001)。结论 结核性胸膜炎患者胸腔积液外泌体miR-506-3p呈低表达、ADA呈高表达,二者之间为负相关,且miR-506-3p联合ADA可有效预测结核性胸膜炎患者不良预后的发生。

清肾颗粒通过调控外泌体、miR-330-3p以及CREBBP表达抑制小鼠肾纤维化

目的探讨清肾颗粒对腺嘌呤诱导的肾纤维化小鼠模型及尿酸刺激下NRK-49F细胞的作用及其调控外泌体、miR-330-3p和CREBBP的机制。方法动物实验:构建腺嘌呤诱导的肾纤维化小鼠模型,分为正常组、模型组和清肾颗粒组(8.0 g·kg^(-1)·d^(-1)),6只/组,灌胃12周。采用尾静脉注射腺相关病毒载体,实验结束后收集双侧肾组织。观察小鼠肾组织外泌体标记蛋白CD9,Hsp70,TSG101蛋白水平变化;Western blotting及免疫荧光检测小鼠肾组织Col-III、α-SMA、FN和E-cad表达变化;HE和Masson染色观察小鼠肾组织病理学变化。细胞实验:构建尿酸刺激下的NRK-49F细胞模型(尿酸400μmol/L),SD大鼠灌胃制备清肾颗粒含药血清用于细胞实验,分为正常组、模型组和清肾颗粒含药血清组。观察NRK-49F细胞中外泌体标记蛋白CD9,Hsp70,TSG101蛋白水平变化;Western blotting及免疫荧光检测NRK-49F细胞中Col-III、α-SMA、FN和E-cad表达变化;双荧光素酶报告基因检测miR-330-3p与CREBBP靶向关系;RT-qPCR和Western blotting检测NRK-49F细胞中miR-330-3p与CREBBP表达变化。结果动物实验中,Western blotting结果显示,与正常组相比,模型组CD9、Hsp70、TSG101蛋白水平升高(P<0.05);与模型组相比,清肾颗粒组CD9、Hsp70、TSG101蛋白水平降低(P<0.05)。Western blotting及免疫荧光结果显示,与正常组相比,模型组Col-III、α-SMA、FN表达增加,E-cad表达减少(P<0.05);与模型组相比,清肾颗粒组Col-III、α-SMA、FN表达减少,E-cad表达增加(P<0.05)。肾脏病理检查显示,清肾颗粒可以明显减轻小鼠肾组织纤维化(P<0.05)。RT-qPCR结果显示,尾静脉注射腺相关病毒病毒载体抑制miR-330-3p表达,增加CREBBP水平,减轻肾纤维化(P<0.05)。双荧光素酶报告基因结果显示,CREBBP是miR-330-3p的靶点(P<0.05)。RT-qPCR和Western blotting结果显示,与正常组相比,模型组miR-330-3p表达增加,CREBBP表达减少(P<0.05);与模型组相比,清肾颗粒组miR-330-3p表达减少,CREBBP表达增加(P<0.05)。细胞实验结果与动物实验结果趋势一致。结论清肾颗粒通过干预外泌体,降低miR-330-3p水平,增加CREBBP表达抑制肾纤维化。

血浆外泌体微RNA-126-5p在儿童注意缺陷多动障碍中的表达及临床意义

目的探究血浆外泌体微RNA-126-5p(miR-126-5p)在儿童注意缺陷多动障碍(ADHD)中的表达及临床意义。方法选取2021年7月至2022年7月在江苏省人民医院确诊的ADHD病儿70例为ADHD组,同时纳入同期江苏省人民医院健康体检的志愿者70例为对照组,采用韦氏幼儿智力量表第4版(WISC-Ⅳ)和家长评定行为量表(SNAP-Ⅳ)评估研究对象的临床症状,采用miRNA测序绘制研究对象的差异miRNA表达谱后寻找关键的miRNA,并利用受试者操作特征曲线(ROC曲线)评价miRNA诊断ADHD的价值,分析miRNA与临床症状的相关性,同时分析miRNA的生物学功能。结果与对照组比较,ADHD病儿WISC-Ⅳ的计算言语理解指数(VCI)[(76.99±6.93)分比(95.30±5.94)分]、知觉推理指数(PRI)[(75.38±4.49)分比(94.69±6.33)分]、工作记忆指数(WMI)[(76.35±7.01)分比(94.11±5.87)分]、加工速度指数(PSI)[(81.36±6.90)分比(89.49±6.20)分]以及总智商(FSIQ)[(79.18±9.30)分比(90.19±5.22)分]的分值显著降低,而SNAP-Ⅳ中注意缺陷和多动/冲动评分明显增高。同时miRNA测序筛选出11个差异miRNAs,其中miR-126-5p在ADHD病儿的血浆外泌体表达升高,并与病儿临床症状存在相关性,且ROC曲线显示miR-126-5p的AUC为0.817,灵敏度为78.6%,特异度为91.4%。此外miR-126-5p主要涉及突触囊泡循环、轴突导向、炎症介质以及长时程增强等生物学功能有关。结论ADHD病儿血浆外泌体miR-126-5p升高,具有诊断ADHD的临床应用价值,同时具有调控突触可塑性和炎症介质参与ADHD的病理机制。