探讨血清外泌体miRNA-132及SIRT1在2型糖尿病伴轻度认知障碍中的诊断价值

目的本研究旨在探索血清外泌体miRNA-132及沉默信息调节因子1(SIRT1)在2型糖尿病(T2DM)伴轻度认知障碍(MCI)患者中的表达水平,以及作为诊断T2DM伴MCI的诊断价值。方法本实验选取泰州市人民医院内分泌科60例2型糖尿病患者,其中认知正常组(T2DM+NCI)30例,轻度认知障碍组(T2DM+MCI)30例,检测血清外泌体miRNA-132及SIRT1的表达水平。结果与T2DM+NCI组相比,T2DM+MCI组患者中性别、年龄、受教育程度、LPA有差异性,具有统计学意义(P<0.05);且血清外泌体miRNA-132、血清SIRT1表达水平降低,亦具有统计学意义(P<0.05)。ROC曲线显示血清外泌体miRNA-132在单独检测时,其灵敏度为0.933,特异度为0.5,曲线下面积(AUC)为0.727。血清SIRT1在单独检测时,灵敏度为0.433,特异度为1,曲线下面积(AUC)为0.673。两者联合检测时,灵敏度为0.867,特异度为0.6,曲线下面积(AUC)为0.752。结论与T2DM+NCI组相比,T2DM+MCI组患者中miRNA-132、SIRT1表达水平同向降低。血清外泌体miRNA-132及血清SIRT1对诊断T2DM伴轻度认知障碍具有一定的意义,二者联合检测时诊断价值更高。

外泌体调节复发性流产小鼠子宫内膜细胞上皮间充质转化的作用机制研究

背景复发性流产(RSA)是常见的生殖障碍性疾病,在胚胎植入过程中,子宫内膜发生上皮间充质转化(EMT),RSA的发生与该过程减弱密切相关。子宫内膜来源外泌体及其携带的miRNA参与细胞间通讯,影响细胞EMT,与RSA关系密切,但具体作用机制尚不明确。目的本研究聚焦于外泌体在细胞EMT中的功能,通过实验验证子宫内膜来源外泌体及其分泌的miRNA-221对RSA小鼠子宫内膜细胞EMT的调控作用。方法2021年10月—2022年5月,选取SPF级、健康8周龄雌性小鼠24只,随机选取12只作为正常对照组,剩余12只小鼠制作RSA模型,造模结束后雌雄合笼,妊娠第4日处死雌性小鼠,分离和培养子宫内膜上皮细胞并收集外泌体,通过透射电镜和免疫印迹法(WB)进行外泌体鉴定;通过CCK-8、Transwell和流式细胞术检测外泌体干预前后两组细胞增殖、侵袭、迁移能力;细胞EMT相关蛋白[E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、基质金属蛋白酶7(MMP-7)、MMP-9]及外泌体标志蛋白(CD63、CD81、TSG101)的表达;外泌体处理后的细胞EMT标志蛋白(CD24-APC、CD44-FITC)的表达;转染miRNA-221模拟物和抑制物分析外泌体源性miRNA-221对小鼠子宫内膜上皮细胞EMT的作用,并通过WB和双荧光素酶报告基因检测进行分析。结果RSA组小鼠的子宫内膜上皮细胞具有异常的EMT,小鼠子宫内膜上皮细胞能够分泌外泌体。添加外泌体的RSA组细胞增殖率、迁移能力、侵袭能力、CD44^(+)/CD24^(+)表达水平高于细胞上清液RSA组(P<0.05)。与细胞上清液RSA组相比,添加外泌体的RSA组细胞的EMT标志蛋白E-cadherin水平降低,间质样标志蛋白N-cadherin和Vimentin以及基质标志蛋白MMP-7、MMP-9蛋白水平升高(P<0.05)。RSA组miRNA-221表达水平低于正常对照组(P<0.05)。与对照随机miRNA相比,miRNA-221模拟物激活了PI3K-AKT通路、NF-κB通路和p38通路(P<0.05)。与对照随机miRNA相比,miRNA-221模拟物降低了PTEN mRNA的表达水平(P<0.05),而miRNA-221抑制剂转染则增加了PTEN mRNA的表达水平(P<0.05)。结论子宫内膜来源外泌体miRNA-221可通过负向调控Pten基因,激活PI3K-AKT通路,促进子宫内膜上皮细胞EMT,影响RSA妊娠结局。

基于miRNA-21a-5p/STAT3轴探讨五虎汤对呼吸道合胞病毒诱导的外泌体诱发哮喘的影响

目的基于miRNA-21a-5p/STAT3轴探讨五虎汤对呼吸道合胞病毒(RSV)诱导的外泌体诱发哮喘的影响。方法SPF级C57小鼠40只,随机分为空白组、模型组、五虎汤组和利巴韦林组,空白组给予PBS滴鼻,其余组给予RSV感染的骨髓间充质干细胞外泌体(BMSCs-Exo-RSV)PBS稀释后滴鼻,隔天1次,共7次。干预结束后24h,空白组、模型组给予蒸馏水灌胃,五虎汤组给予五虎汤煎剂灌胃,利巴韦林组给予利巴韦林稀释水溶液灌胃,共干预1周。干预期间观察各组小鼠的一般行为变化,评估有无哮喘症状和体征的出现,干预结束后取小鼠肺组织检测。使用HE、Masson染色观察肺组织炎症浸润和胶原沉积情况,RT-qPCR法检测肺组织中miRNA-21a-5p及STAT3 mRNA表达情况,Western blot法检测免疫组化法检测肺组织中STAT3、p-STAT3蛋白表达情况,体外双荧光素酶实验验证miRNA-21与STAT3 mRNA的靶向调控作用。结果与空白组相比,模型组小鼠出现哮喘典型改变,肺组织中炎症浸润和胶原沉积明显增多,肺组织中miRNA-21a-5p、STAT3 mRNA和p-STAT3表达水平升高(P<0.01)。与模型组相比,五虎汤组小鼠症状和体征改善,肺组织中miRNA-21a-5p、STAT3 mRNA和p-STAT3表达水平均下降(P<0.01)。体外双荧光素酶结果显示:miRNA-21a-5p能够靶向促进STAT3 mRNA的表达(P<0.05)。结论BMSCs-Exo-RSV能够激活miRNA-21a-5p/STAT3轴,促进小鼠肺组织中miRNA-21a-5p、STAT3mRNA和p-STAT3蛋白的表达,引起气道炎症和重塑,从而诱发哮喘,而五虎汤则能通过逆转以上环节改善哮喘。

内皮祖细胞外泌体中miRNA-222-3p对糖尿病小鼠皮肤伤口愈合的影响

目的了解内皮祖细胞外泌体(EPCs-Exo)中的miRNA-222-3p对糖尿病小鼠皮肤伤口愈合的影响。方法采用荧光染色法对C57BL/6小鼠骨髓来源内皮祖细胞(EPCs)进行鉴定。对从EPCs培养基中分离出的EPCs-Exo进行鉴定以及miRNA高通量测序。建立糖尿病小鼠皮肤损伤模型,随机分为5组:PBS组、EPCs-Exo组、空白组、agomiR-222-3p组、antagomiR-222-3p组。根据不同分组,连续处理14 d,观察创面愈合率,免疫荧光方法了解治疗前后创缘组织中活性氧(ROS)、血管内皮生长因子(VEGF)、CD31表达水平变化。结果EPCs-Exo促进糖尿病小鼠皮肤伤口愈合,降低创缘组织中ROS表达水平,增加VEGF、CD31表达水平(P<0.05)。高通量测序提示miRNA-222-3p在EPCs-Exo中高度表达。创缘组织局部皮下注射miRNA-222-3p可显著促进糖尿病小鼠皮肤伤口愈合,降低创缘组织中ROS表达水平,增加VEGF、CD31表达水平(P<0.05)。结论miRNA-222-3p促进糖尿病小鼠伤口愈合,在EPCs-Exo促进创面愈合过程中发挥重要作用。

PF-127水凝胶联合骨髓间充质干细胞外泌体来源miR-132诱导成骨分化修复牙槽骨缺损

目的:探究PF-127水凝胶联合骨髓间充质干细胞外泌体来源miR-132诱导成骨分化对牙槽骨缺损的修复作用。方法:培养骨髓间充质干细胞,(bone mesenchymal stem cells,BMSCs),并转染anti-miR-132、anti-miR-NC质粒。制备BMSCs来源外泌体(bone mesenchymal stem cells-exosomes,BMSCs-exo),蛋白质印迹法鉴定表达标志物。制备PF-127水凝胶和BMSCs-Exo复合物,PKH67标记法检测BMSCs的摄取;茜素红染色检测BMSCs的成骨能力;逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)检测细胞中miR-132表达和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨钙素(osteocalcin,OCN)、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)mRNA表达。建立牙槽骨缺损大鼠模型,将大鼠随机分为PF-127水凝胶组、PF-127水凝胶+BMSCs-exo-anti-miR-NC组和PF-127水凝胶+BMSCs-exo-anti-miR-132组。微型计算机断层扫描(Micro-computed tomography,micro-CT)评估牙槽骨缺损情况;蛋白质印迹法检测牙槽骨组织中ALP、OCN、Runx2蛋白表达。结果:anti-miR-132组BMSCs中miR-132表达明显低于anti-miR-NC组(P<0.05),提示anti-miR-132成功转染至BMSCs中。BMSCs-exo-anti-miR-NC组和BMSCs-exo-anti-miR-132组中外泌体标志物CD9和CD63显著表达。和BMSCs-exo-anti-miR-NC组相比,BMSCs-exo-anti-miR-132组中miR-132表达明显降低(P<0.05)。和PF127水凝胶组相比,BMSC-exo-anti-miR-NC组、PF127水凝胶+BMSC-exo-anti-miR-NC组、PF127水凝胶+BMSC-exo-anti-miR-132组中miR-132表达均明显降低,茜素红染色相对活性、细胞中Runx2、ALP和OCN mRNA表达均明显增加,且PF127水凝胶+BMSC-exo-anti-miR-132组变化最显著(P<0.05)。和Control组相比,PF-127水凝胶+BMSCs-exo-anti-miR-NC组和PF-127水凝胶+BMSCs-exo-anti-miR-132组BV/TV比值、BMD、Tb.N和Tb.Th及细胞中Runx2、ALP、OCN蛋白表达均明显升高,Tb.Sp明显降低(P<0.05),且PF-127水凝胶+BMSCs-exo-anti-miR-132组变化最显著。结论:PF-127水凝胶联合骨髓间充质干细胞来源外泌体来源干扰miR-132表达可促进骨髓间充质干细胞的成骨分化,从而促进牙槽骨缺损大鼠的修复。

清宣通络方通过外泌体miRNA-146a靶向TRAF6基因抑制肺炎支原体感染诱导肺泡上皮细胞炎性损伤的研究

[目的]基于外泌体miRNA-146a调控肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)基因探讨清宣通络方抑制肺炎支原体(MP)感染诱导肺泡上皮细胞炎性损伤的作用机制。[方法] 24只实验小鼠随机分为空白组、肺炎支原体肺炎(MPP)组、阿奇霉素组、清宣通络方组,给药结束后观察小鼠体温、咳嗽情况,进行肺组织苏木精-伊红(HE)染色、病理评分及聚合酶链式反应(PCR)鉴定。肺泡上皮细胞分为正常对照组、MP感染组、miRNA-146a过表达/抑制剂组和miRNA-NC阴性对照组;采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)技术检测肺泡上皮细胞来源外泌体、肺组织中miRNA-146a及肺泡上皮细胞中TRAF6 mRNA表达水平;ELISA法检测培养液上清中白介素-17(IL-17)、白介素(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量。[结果]与空白组相比,MPP组小鼠出现体温升高、咳嗽次数增加、咳嗽潜伏期缩短、肺组织病理评分增高(P均<0.01);与MPP组相比,清宣通络方组小鼠体温降低、咳嗽次数减少、咳嗽潜伏期增加、肺组织病理评分下降(P均<0.01)。与正常对照组相比,MP感染组外泌体miRNA-146a水平下降,肺泡上皮细胞TRAF6 mRNA及培养液上清中IL-17、IL-6、TNF-α含量上升(P均<0.05)。与MP感染组相比,miRNA-146a过表达组外泌体miRNA-146a水平上调,肺泡上皮细胞TRAF6 mRNA及培养液上清IL-17、IL-6、TNF-α水平下降(P均<0.05);miRNA-146a抑制组外泌体miRNA-146a下降,肺泡上皮细胞TRAF6 mRNA及培养液上清中IL-17、IL-6、TNF-α水平上升(P均<0.05)。与miRNA-146a抑制剂组相比,清宣通络方外泌体干预组培养液上清中炎性因子水平降低(P均<0.01);与MPP组相比,清宣通络方组小鼠肺组织中miRNA-146a含量升高(P<0.01)。[结论]清宣通络方可能通过上调外泌体miRNA-146a,靶向调控TRAF6基因,进而影响IL-17、IL-6和TNF-α等炎性因子表达,抑制MP感染诱导的炎性损伤。

外泌体miRNA-126对缺血性脑卒中合并代谢相关脂肪性肝病患者的相关性研究

脑卒中(cerebral stroke)又称为“中风”、“脑血管意外”,是全球第二大死亡原因及第三大致残原因。根据临床表现和病因分为:缺血性卒中和出血性卒中,前者约占全球所有卒中的71%。代谢相关脂肪性肝病(metabolic related fatty liver disease, MAFLD)曾用名为非酒精性脂肪性肝病(NAFLD),已经取代病毒性肝炎,成为我国慢性肝病的第一大病因。MAFLD作为多系统代谢功能紊乱疾病,可通过代谢相关的多种机制增加2型糖尿病(T2DM)、缺血性脑卒中和心血管疾病的风险。近年来的研究以外泌体的物质构成、运输、细胞间通讯多个功能为出发点,为临床疾病诊断及预后、治疗靶点提供了新手段。外泌体天然存在于各类型体液中,也可被所有类型细胞分泌,目前对外泌体的探究趋势已经从集中于肿瘤源性转变至对自身免疫性疾病、代谢疾病和缺血性疾病等非肿瘤性疾病的研究。外泌体的高度特异性和敏感性,使其可以作为一种疾病早期非侵入性新型诊断指标,本文就外泌体miRNA-126与缺血性脑卒中合并MAFLD患者的相关性作一综述。

血清外泌体miRNA-21、miRNA-214联合检测在骨质疏松症诊断中的价值

目的探讨骨质疏松症(OP)患者血清外泌体中微小RNA(miRNA)-21和miRNA-214的相对表达水平及其对OP的诊断价值。方法选取重庆市人民医院2022年1月至2023年12月收治的77例OP患者作为OP组,另选取同期该院81例健康体检者为健康对照组。分离并鉴定血清外泌体,提取外泌体miRNA。采用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测两组血清外泌体中miRNA-21和miRNA-214的相对表达水平。采用受试者工作特征(ROC)曲线评估血清外泌体中miRNA-21和miRNA-214对OP的诊断价值。结果分离的血清外泌体中CD63标志蛋白呈高表达。OP组血清外泌体miRNA-21和miRNA-214相对表达水平分别为5.302(2.407,9.765)和1.875(1.605,2.450),明显高于对照组的1.338(0.801,2.088)和1.163(0.860,1.391),差异均有统计学意义(P<0.05)。多因素Logistic回归分析结果显示,血清外泌体miRNA-21、miRNA-214相对表达水平升高是导致OP的危险因素(P<0.05)。ROC曲线结果显示,血清外泌体miRNA-21、miRNA-214诊断OP的AUC分别为0.853、0.811,灵敏度分别为80.5%、89.6%,特异度分别为79.0%、82.7%,二者联合诊断OP的AUC为0.919,灵敏度为90.9%,特异度为84.0%。结论血清外泌体miRNA-21和miRNA-214单独检测对诊断OP具有一定的价值,二者联合检测可提高诊断的准确性,有临床应用价值。

miR-141-5p/ZNF705A对慢性粒细胞白血病细胞源外泌体调控骨髓间充质干细胞黏附作用的机制

目的探讨慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)细胞源外泌体(exosome,Exo)中miR-141-5p/ZNF705A对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)黏附作用的影响。方法电镜和NTA粒径分析检测CML患者外周血和K562细胞中的Exo形态大小;qRT-PCR和Western blot检测转染前后K562细胞的Exo、BMSCs标记分子及黏附蛋白的表达情况;细胞黏附实验检测BMSCs的黏附能力;CCK-8法检测BMSCs活性、萤光素酶实验检测miR-141-5p与ZNF705A结合情况等。结果qRT-PCR结果显示,miR-141-5p表达在CML患者和K562细胞源Exo中均明显降低;qRT-PCR和Western blot等结果表明,CML患者中BMSCs的黏附蛋白CD44和CXCL12表达明显降低,且能够吞噬K562细胞源Exo。进一步发现,与CD34^(+)细胞相比,K562源性Exo能够降低Exo促进的BMSCs中CD44和CXCL12表达和黏附作用;同时,双萤光素酶基因报告等验证miR-141-5p与ZNF705A靶向结合;最后发现通过上调K562细胞源Exo中miR-141-5p的表达,靶向抑制ZNF705A,进而促进BMSCs的活性和黏附功能。结论K562细胞下调Exo中miR-141-5p表达,减少对ZNF705A的靶向抑制,进而抑制BMSCs的黏附功能,从而调控CML患者的骨髓造血功能。

血清外泌体来源的miRNA-122对肝癌诊断的研究

目的探讨原发性肝癌(HCC)患者血清中外泌体来源的miRNA-122的表达水平,以评价其在肝癌早期的诊断价值。方法以外泌体提取试剂盒分离纯化HCC患者和健康体检者血清中外泌体,通过蛋白免疫印迹(Western blot)检测Hsp70,CD63和Alix外泌体标记蛋白分子,透射电镜鉴定血清外泌体形态;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测82例HCC患者和79例健康体检者中miRNA-122的水平;以外泌体miRNA-122水平鉴别HCC患者和健康体检者的诊断效能。结果 Western blot显示出血清外泌体Hsp70,CD63和Alix等标记分子的表达,透射电镜鉴定外泌体形态符合一般外泌体特征;qRT-PCR结果表明,HCC组中的miRNA-122[log10(0.62±0.89)]较健康对照组[log10(-0.78±0.77)]血清外泌体升高,差异有统计学意义(P<0.001);血清外泌体来源的miRNA-122诊断肝癌的敏感度为81.93%、特异度为82.05%,曲线下面积为0.89(95%CI:0.84~0.94)。结论血清外泌体来源的miRNA-122可作为一种新的肿瘤标志物用于原发性肝癌的早期临床诊断。

骨髓间充质干细胞来源外泌体miRNA-320a调控CXCL9表达在类风湿关节炎发生与发展中的作用及机制

目的探讨人骨髓间充质干细胞(hBMMSCs)来源外泌体miRNA-320a调控CXC趋化因子配体9(CXCL9)表达在类风湿关节炎(RA)中的作用及机制。方法分离并鉴定h BMMSCs来源外泌体。收集于医院接受关节置换术的RA患者关节滑膜组织,制备类风湿关节炎滑膜成纤维细胞(RASFs)。q RT-PCR法检测RASFs和hBMMSCs来源外泌体中miRNA-320a和CXCL9表达。双荧光素酶报告基因验证miRNA-320a与CXCL9靶向关系。分别采用CCK-8法和Transwell实验,检测BMMSCs来源外泌体miRNA-320a通过下调CXCL9对RASFs增殖和迁移的影响。结果RASFs中miRNA-320a呈异常低表达,与hBMMSCs来源外泌体共培养后,miRNA-320a表达显著上调(P<0.05);miRNA-320a+CXCL9 WT组荧光强度显著低于miRNA-NC+CXCL9 WT组(P<0.05),而miRNA-320a+CXCL9 MUT组和miRNA-NC+CXCL9 MUT组荧光强度比较,差异无统计学意义(P>0.05);与miR-NC+oe-NC组比较,miR-320a mimic+oe-NC组miR-320a表达显著增加,CXCL9 mRNA表达显著降低,RASFs增殖和迁移能力显著下降(P<0.05);与miR-320a mimic+oe-NC组比较,miR-320a mimic+oe-CXCL9组CXCL9 mRNA表达显著增加,RASFs增殖和迁移能力显著上升(P<0.05)。结论h BMMSCs来源外泌体miRNA-320a可通过靶向下调CXCL9水平,抑制RASFs增殖和迁移,miR-320a有可能成为RA诊断标志物和潜在治疗靶点。

血清外泌体miRNA-223在宫颈癌诊断及预后评价中的价值研究

目的:探讨血清外泌体miRNA-223在宫颈癌诊断及预后评价中的价值。方法:采用RT-PCR法检测168例宫颈癌患者(宫颈癌组)和160例健康人(对照组)血清外泌体miRNA-223的表达水平,受试者工作特征(ROC)曲线分析miRNA-223诊断宫颈癌的价值,计算曲线下面积(AUC)、诊断灵敏度和特异度;Kaplan-Meier法比较miRNA-223高表达患者和低表达患者的总体生存时间;Cox比例风险模型分析影响宫颈癌患者预后的因素。结果:宫颈癌组血清外泌体miRNA-223的相对表达量为2.26±0.68,明显高于对照组的0.89±0.21,差异有统计学意义(t=23.199,P<0.001)。血清外泌体miRNA-223诊断宫颈癌AUC为0.928(95%CI:0.867~0.976),灵敏度和特异度分别为86.55%和94.37%。血清外泌体miRNA-223表达水平与FIGO分期、淋巴结转移和宫颈浸润深度有关(P<0.0.5)。FIGO分期Ⅱb~Ⅲa、淋巴结转移、宫颈浸润深度≥2/3、miRNA-223高表达是宫颈癌患者总生存期和无病生存期的独立影响因素(P<0.05)。结论:血清外泌体miRNA-223对宫颈癌的早期诊断及预后判断有一定价值,其表达水平越高,患者的生存预后越差。

血清外泌体miRNA-30a-5p在人脑胶质瘤诊断及预后评价中的作用

目的探讨胶质瘤病人血清外泌体miRNA-30a-5p的表达水平,及其在胶质瘤诊断及预后评估中的价值。方法选取2014年1月至2015年12月收治的胶质瘤60例为研究对象,另选取健康体检者40例为对照。RT-PCR检测血清外泌体miRNA-30a-5p表达水平。用受试者工作特性(ROC)曲线分析miRNA-30a-5p诊断胶质瘤的价值。用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,采用log-rank检验;多因素Cox比例风险回归模型分析预后危险因素。结果胶质瘤病人血清外泌体miRNA-30a-5p表达水平明显高于健康人(P<0.001)。ROC曲线分析显示,血清外泌体miRNA-30a-5p诊断胶质瘤的曲线下面积为0.901(95%CI0.812~0.986),最佳截断值为0.601,此时miRNA-30a-5p诊断胶质瘤的灵敏度和特异度分别为78.05%和93.55%。术后60例均得到有效随访,随访时间平均(28.39±3.25)个月。Kaplan-Meier分析结果显示,血清外泌体miRNA-30a-5p低表达病人总体生存时间高于高表达病人(P<0.001)。多因素Cox比例回归风险模型分析结果显示血清外泌体miRNA-30a-5p高表达是胶质瘤病人不良预后的独立影响因素(P<0.05)。结论血清外泌体miRNA-30a-5p对胶质瘤的诊断和预后评价均有一定价值。

miRNA-330-3p/Ap2m1轴在过表达GATA-4骨髓间充质干细胞外泌体抗心肌细胞凋亡中的作用

目的探讨过表达GATA-4小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)分泌外泌体(BMSC^(GATA-4)exosome)通过miRNA-330-3p/Ap2m1轴减少心肌细胞凋亡,提高心肌梗死心功能。方法建立小鼠心梗模型,共分7组,分别经尾静脉注射BMSC^(miRNA-330-3p-mimic)-exosome、BMSC^(miRNA-330-3p-inhibitor)-exosome、BMSC^(空载体)-exosome、BMSCexosome 48 h,同时将心梗未处理组及正常小鼠作为对照组。采用心脏彩超检测各组心功能,RT-PCR检测心梗心肌细胞内miRNA-330-3p的表达,Tunel法检测各组心梗心肌细胞凋亡数量。miRNA-330-3p对应靶基因Ap2.m1、Cnot4蛋白采用Western blot法进行检测。结果BMSC^(miRNA-330-3p-mimic)-exosome组心梗心功能改善最为明显(P<0.05),其心肌细胞内miRNA-330-3p表达量最高(P<0.05)。BMSC^(miRNA-330-3p-mimic)-exosome组心肌细胞的凋亡率最低(P<0.05),BMSC^(miRNA-330-3p-mimic)-exosome组心梗心肌细胞内的Ap2.m1的表达最低(P<0.05)。结论过表达GATA-4小鼠骨髓间充质干细胞外泌体通过miRNA-330-3p/Ap2m1轴抗心肌细胞凋亡。

外泌体介导miRNA-155靶向CTHRC1对胃癌细胞腹膜种植转移的影响

目的探讨外泌体转运miRNA-155靶向胶原三螺旋重复蛋白1(CTHRC1)对胃癌细胞腹膜种植转移的影响。方法提取胃癌BCG-823细胞外泌体并采用透射电子显微镜鉴定;实时荧光定量PCR检测胃癌BCG-823细胞和外泌体miRNA-155水平;激光共聚焦显微镜观察人腹膜间皮HMrSV5细胞对外泌体吞噬情况;设立阴性对照组、外泌体组和miRNA-155mimic组,通过划痕实验检测外泌体转运miRNA-155对腹膜间皮细胞HMrSV5迁移力的影响;利用生物信息预测软件结合荧光素酶报告基因检测验证miRNA-155的靶基因;Western blotting检测细胞CTHRC1蛋白表达。结果提取的外泌体呈现杯口状,直径40-150nm,外泌体标志性蛋白CD9、CD81呈阳性,而内质网分子伴侣Calnexin不表达;外泌体miRNA-155表达水平显著高于胃癌BCG-823细胞(P<0.05);采用PKH26对外泌体标记后在显微镜下呈红色,其主要分布在人腹膜间皮细胞HMrSV5的细胞质内,且视野下大部分细胞均可见红色荧光。利用生物分析软件(TargetScan,CLIP-Seq,miRDB and miRanda)预测了miRNA-155的下游靶基因为CTHRC1。与阴性对照组比较,外泌体组和miRNA-155mimic组腹膜间皮细胞迁移力、细胞增殖、细胞活力和细胞迁移显著增加,且miRNA-155mimic组高于外泌体组,其中外泌体中miRNA-155表达水平为0.49±0.03,CTHRC1蛋白表达水平显著降低,且miRNA-155mimic组低于外泌体组(P<0.05)。结论胃癌细胞来源的外泌体可促进腹膜间皮细胞迁移,因此增加肿瘤转移风险,其机制可能是外泌体内过表达的miRNA-155靶向抑制CTHRC1蛋白表达水平所引起。

外泌体miRNA-21对非小细胞肺癌风险预测价值的研究

目的探讨外周血中外泌体miRNA-21、EGFR基因突变、肺癌相关肿瘤标志物CEA、SCCA、CYFRA21-1在非小细胞肺癌(non small cell lung cancer, NSCLC)风险预测中的价值。方法选取2017年6月至11月于河南省肿瘤医院确诊NSCLC患者30例为实验组和来河南中医药大学第一附属医院健康体检正常人30例为对照组,采集其外周血样本5mL,取血清样本进行外泌体提取;采用qRT-PCR检测血清样本中外泌体miRNA-21表达量;采用液态芯片分析系统检测血清样本中肿瘤标志物CEA、SCCA、CYFRA21-1含量;采用数字PCR技术检测血清样本中肺癌驱动基因EGFR突变情况。结果 NSCLC组外泌体miRNA-21表达量为119.6498.35,正常人组外泌体miRNA-21表达量为39.1034.12,差异有统计学意义(P<0.05),行ROC曲线计算该指标对NSCLC的诊断价值,曲线下面积为87.6%;NSCLC组EGFR基因突变率为43.3%,正常人组EGFR基因无突变,通过EGFR基因是否突变对NSCLC进行风险预测,特异性为100%,敏感性为43.3%;通过绘制ROC曲线,CEA、SCCA、CYFRA21-1曲线下面积分别为52.1%、65.0%、60.9%,诊断效能较低,但如果三项指标联合诊断,曲线下面积显著提高至77.3%,但仍低于血清外泌体miRNA-21的86.7%。结论外泌体miRNA-21具有较高的NSCLC风险预测价值,而EGFR基因突变、肺癌相关肿瘤标志物的NSCLC风险预测价值相对较低。

血浆外泌体来源的miRNA-323a-3p作为结核病潜在生物标志物的评估

目的·研究血浆外泌体来源的microRNA(miRNA),为结核病的诊断寻找潜在标志物。方法·采用卡介苗(Bacille CalmetteGuérin,BCG,即减毒牛分枝结核杆菌)感染人单核细胞白血病细胞(THP-1)来源的巨噬细胞(BCG组),设置未感染细胞为对照组。利用超速离心法获取2组细胞培养上清液中的外泌体,通过透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)、蛋白质印迹法进行形态学及蛋白标志物鉴定,并对外泌体进行转录组测序分析。选取测序结果中的3个差异表达miRNAs,就10例结核病患者(结核病组)和8例健康志愿者(健康对照组)的血浆外泌体进行临床验证。通过TargetScan、miRDB和PicTar数据库对存在潜在差异表达的miRNA进行靶基因预测。结果·细胞培养上清液外泌体测序结果显示,与对照组相比,miRNA-323a-3p、miRNA-29a-3p和miRNA-29b-3p在BCG组的表达均有显著差异,而在临床验证中仅有miRNA-323a-3p在2组表达间的差异具有统计学意义(P=0.004);且miRNA-323a-3p在结核患者血浆来源的外泌体中显著下调,与转录组结果一致。结论·血浆外泌体来源的miRNA-323a-3p在结核患者中的表达显著下调,且其靶基因与自噬作用密切相关,有望为结核病的机制研究提供新思路。

装载微RNA-132的间充质干细胞来源外泌体在缺氧条件下对人脐静脉内皮细胞功能的影响

目的探讨装载miRNA-132的间充质干细胞外泌体在缺氧环境中对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的保护作用及其机制。方法通过电转法分别将miRNA-132阴性对照(NC)和miRNA-132 mimics转入间充质干细胞来源的外泌体中,即为对照外泌体(Exo)和装载miRNA-132的外泌体(miRNA-132 Exo)。在低氧培养箱中,分别用等体积的PBS、Exo和miRNA-132 Exo与HUVEC共培养48 h。利用CCK-8法检测各组细胞增殖能力,采用管样形成实验检测细胞成管能力,利用Transwell迁移实验检测细胞迁移能力。通过TargetScan数据库预测miRNA-132的下游靶基因,并通过双萤光素酶报告基因实验、qPCR和蛋白质印迹法进行验证。结果电转法成功将miRNA-132 mimics转入外泌体中。在缺氧条件下培养48 h后,Exo组与miRNA-132 Exo组HUVEC的增殖能力、成管能力和迁移能力均优于PBS组(P均<0.05),并且miRNA-132 Exo组HUVEC的增殖能力、成管能力和迁移能力均优于Exo组(P均<0.01)。经TargetScan数据库筛选发现Ras p21蛋白活化子1(RASA1)可能为miRNA-132的靶点并与血管形成过程有关。双萤光素酶报告基因实验证实RASA1是miRNA-132的靶点,qPCR和蛋白质印迹法结果显示缺氧条件下加miRNA-132 Exo处理能抑制HUVEC中RASA1的表达。结论无论是否装载miRNA-132,间充质干细胞来源的外泌体均可在缺氧环境中保护HUVEC的增殖能力、成管能力和迁移能力,miRNA-132可能通过抑制RASA1的表达增强了这种保护作用。

血清外泌体miRNA-184在非小细胞肺癌中的表达水平及其诊断效能

目的分析血清外泌体miRNA-184在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达情况及其对NSCLC的诊断效能。方法回顾性分析NSCLC患者(66例)、肺炎患者(60例)的临床资料及同期健康体检者(30例)的体检结果。3组受试者均采集血清标本,提取经纯化鉴定的血清外泌体中miRNA,检测并比较3组受试者的血清外泌体miRNA-184的表达情况,采用受试者工作特征(ROC)曲线评价血清外泌体miRNA-184在NSCLC中的诊断效能。结果 3组受试者血清外泌体miRNA-184的表达水平比较,差异有统计学意义(P﹤0.05);NSCLC患者血清外泌体miRNA-184表达水平明显高于肺炎患者和体检健康者(P﹤0.01)。ROC曲线分析显示,miRNA最佳的相对表达量临界值为1.26,曲线下面积为0.915(95%CI:0.84～0.99),血清外泌体miRNA-184诊断NSCLC的灵敏度为77.4%,特异度为96.8%。结论相对于肺炎患者和健康体检者,NSCLC患者的血清外泌体miRNA-184表达水平较高,其临床诊断效能较高,可能是诊断早期NSCLC的潜在的生物学标志物。

结直肠癌患者血浆外泌体中miRNA-23b的表达及其临床意义

目的探究结直肠癌患者血浆外泌体中miRNA-23b(miR-23b)表达水平与临床病理学特征及预后的关系。方法利用外泌体试剂盒提取65例结直肠癌患者和25例健康人血浆中的外泌体,分别使用透射电镜、Western Blot和纳米颗粒示踪法进行鉴定。采用RT-qPCR法检测外泌体中miR-23b的表达水平,并分析其与患者临床病理学特征及预后的关系。结果结直肠癌患者血浆外泌体中miR-23b的表达水平较正常健康人明显降低(P <0.001),其低表达与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移、TNM分期、脉管浸润、神经侵犯显著相关(均P <0.05)。Kaplan-Meier生存分析显示,外泌体miR-23b低表达组患者的总生存期较高表达组明显缩短(P=0.003)。单因素和多因素分析表明,血浆外泌体中miR-23b低表达是影响结直肠癌患者总生存期的独立危险因素(HR=2.243,95%CI:1.093~5.024,P=0.029)。结论结直肠癌患者血浆外泌体中miR-23b的表达下调与多个不良临床病理学因素及较短的总生存期密切相关,具有成为评估结直肠癌预后生物标志物的潜力。