内皮祖细胞外泌体中miRNA-222-3p对糖尿病小鼠皮肤伤口愈合的影响

目的了解内皮祖细胞外泌体(EPCs-Exo)中的miRNA-222-3p对糖尿病小鼠皮肤伤口愈合的影响。方法采用荧光染色法对C57BL/6小鼠骨髓来源内皮祖细胞(EPCs)进行鉴定。对从EPCs培养基中分离出的EPCs-Exo进行鉴定以及miRNA高通量测序。建立糖尿病小鼠皮肤损伤模型,随机分为5组:PBS组、EPCs-Exo组、空白组、agomiR-222-3p组、antagomiR-222-3p组。根据不同分组,连续处理14 d,观察创面愈合率,免疫荧光方法了解治疗前后创缘组织中活性氧(ROS)、血管内皮生长因子(VEGF)、CD31表达水平变化。结果EPCs-Exo促进糖尿病小鼠皮肤伤口愈合,降低创缘组织中ROS表达水平,增加VEGF、CD31表达水平(P<0.05)。高通量测序提示miRNA-222-3p在EPCs-Exo中高度表达。创缘组织局部皮下注射miRNA-222-3p可显著促进糖尿病小鼠皮肤伤口愈合,降低创缘组织中ROS表达水平,增加VEGF、CD31表达水平(P<0.05)。结论miRNA-222-3p促进糖尿病小鼠伤口愈合,在EPCs-Exo促进创面愈合过程中发挥重要作用。

清肾颗粒通过调控外泌体、miR-330-3p以及CREBBP表达抑制小鼠肾纤维化

目的探讨清肾颗粒对腺嘌呤诱导的肾纤维化小鼠模型及尿酸刺激下NRK-49F细胞的作用及其调控外泌体、miR-330-3p和CREBBP的机制。方法动物实验:构建腺嘌呤诱导的肾纤维化小鼠模型,分为正常组、模型组和清肾颗粒组(8.0 g·kg^(-1)·d^(-1)),6只/组,灌胃12周。采用尾静脉注射腺相关病毒载体,实验结束后收集双侧肾组织。观察小鼠肾组织外泌体标记蛋白CD9,Hsp70,TSG101蛋白水平变化;Western blotting及免疫荧光检测小鼠肾组织Col-III、α-SMA、FN和E-cad表达变化;HE和Masson染色观察小鼠肾组织病理学变化。细胞实验:构建尿酸刺激下的NRK-49F细胞模型(尿酸400μmol/L),SD大鼠灌胃制备清肾颗粒含药血清用于细胞实验,分为正常组、模型组和清肾颗粒含药血清组。观察NRK-49F细胞中外泌体标记蛋白CD9,Hsp70,TSG101蛋白水平变化;Western blotting及免疫荧光检测NRK-49F细胞中Col-III、α-SMA、FN和E-cad表达变化;双荧光素酶报告基因检测miR-330-3p与CREBBP靶向关系;RT-qPCR和Western blotting检测NRK-49F细胞中miR-330-3p与CREBBP表达变化。结果动物实验中,Western blotting结果显示,与正常组相比,模型组CD9、Hsp70、TSG101蛋白水平升高(P<0.05);与模型组相比,清肾颗粒组CD9、Hsp70、TSG101蛋白水平降低(P<0.05)。Western blotting及免疫荧光结果显示,与正常组相比,模型组Col-III、α-SMA、FN表达增加,E-cad表达减少(P<0.05);与模型组相比,清肾颗粒组Col-III、α-SMA、FN表达减少,E-cad表达增加(P<0.05)。肾脏病理检查显示,清肾颗粒可以明显减轻小鼠肾组织纤维化(P<0.05)。RT-qPCR结果显示,尾静脉注射腺相关病毒病毒载体抑制miR-330-3p表达,增加CREBBP水平,减轻肾纤维化(P<0.05)。双荧光素酶报告基因结果显示,CREBBP是miR-330-3p的靶点(P<0.05)。RT-qPCR和Western blotting结果显示,与正常组相比,模型组miR-330-3p表达增加,CREBBP表达减少(P<0.05);与模型组相比,清肾颗粒组miR-330-3p表达减少,CREBBP表达增加(P<0.05)。细胞实验结果与动物实验结果趋势一致。结论清肾颗粒通过干预外泌体,降低miR-330-3p水平,增加CREBBP表达抑制肾纤维化。

非小细胞肺癌患者血清外泌体lncRNA MEG8、miR-363-3p表达与病理特征的关系

目的 探讨非小细胞肺癌(NSCLC)患者血清外泌体长链非编码核糖核酸母系表达基因8(lncRNA MEG8)、微小核糖核酸-363-3p(miR-363-3p)表达与病理特征的关系。方法 选取2021年1月至2023年5月四川大学华西医院收治的93例NSCLC患者为NSCLC组,另选取同期43例健康志愿者为对照组。采用实时荧光定量聚合酶链式反应检测血清外泌体lncRNA MEG8、miR-363-3p水平。通过StarBase数据库预测lncRNA MEG8与miR-363-3p的关系。采用Pearson相关法分析NSCLC患者血清外泌体lncRNA MEG8与miR-363-3p水平的相关性,受试者工作特征(ROC)曲线分析血清外泌体lncRNA MEG8、miR-363-3p水平对NSCLC的诊断价值。结果 与对照组比较,NSCLC组血清外泌体lncRNA MEG8水平升高(P<0.05),miR-363-3p水平降低(P<0.05)。经StarBase数据库预测,lncRNA MEG8与miR-363-3p存在互补序列。Pearson相关性分析显示,NSCLC患者血清外泌体lncRNA MEG8与miR-363-3p水平呈负相关(r=-0.730,P<0.001)。不同分化程度(低分化与中/高分化)、TNM分期(Ⅰ~Ⅱ期与Ⅲ~Ⅳ期)、淋巴结转移(有与无)NSCLC患者血清外泌体lncRNA MEG8、miR-363-3p水平比较有差异(P<0.05)。ROC曲线分析显示,血清外泌体lncRNA MEG8、miR-363-3p水平联合诊断NSCLC的曲线下面积为0.965,大于血清外泌体lncRNA MEG8、miR-363-3p水平单独诊断的0.908、0.904(P<0.05)。结论 NSCLC患者血清外泌体lncRNA MEG8水平升高,miR-363-3p水平降低,与分化程度、TNM分期和淋巴结转移有关,血清外泌体lncRNA MEG8、miR-363-3p水平联合诊断NSCLC的价值较高。

COPD患者肺泡灌洗液来源外泌体通过miR-223-3p/FOXO3通路抑制成骨细胞成骨分化的作用

目的探索慢性阻塞性肺病患者肺泡灌洗液来源的外泌体(COPD-bronchoalveolar lavage fluid-exosome,COPD-Exo)调控成骨细胞分化的作用及机制。方法选取2023年6月于陆军军医大学第一附属医院就诊的6例COPD患者和6例非COPD患者(对照),在临床肺泡灌洗过程中收集肺泡灌洗液,提取COPD-Exo、非COPD患者肺泡灌洗液来源的外泌体(ctrl-bronchoalveolar lavage fluid-exosome,Ctrl-Exo),使用电镜和Western blot进行鉴定。使用茜素红染色、qRT-PCR检测COPD-Exo干预成骨细胞后成骨分化水平的改变。对GEO数据库数据集(GSE218571)中COPD-Exo的微小RNA(microRNA,miRNA)表达谱进行生物信息学分析,获得COPD-Exo中差异表达的miRNA,使用Antagomir阻碍MircoRNA功能,明确具有成骨分化调控功能的miRNA,使用Targetscan软件预测miRNA的下游靶基因并进行验证。结果COPD患者和非COPD患者的肺泡灌洗液内均可提取出外泌体。茜素红染色及PCR结果表明,COPD-Exo可以抑制人hFOB 1.19成骨细胞的成骨分化(P<0.05)。生物信息学分析显示,COPD-Exo中miR-223-3p表达水平显著上调。使用Antagomir阻碍miR-223-3p可减轻COPD-Exo对于人hFOB 1.19成骨细胞的成骨分化抑制(P<0.05)。Targetscan预测和Western blot结果显示miR-223-3p可能靶向抑制成骨分化相关因子FOXO3的表达(P<0.05)。结论COPD-Exo可能通过miR-223-3p抑制人hFOB 1.19成骨细胞的成骨分化,该过程与miR-223-3p抑制FOXO3表达有关。

幽门螺杆菌诱导的胃癌细胞源性外泌体miR-382-5p通过靶向PTEN抑制巨噬细胞自噬并促进其M2极化

目的:探讨幽门螺杆菌(H.pylori)诱导的人胃癌细胞源性外泌体miR-382-5p对巨噬细胞自噬和极化的影响及机制,为进一步阐明H.pylori的致癌机制提供新线索。方法:超高速离心法和试剂盒提取H.pylori刺激组和对照组AGS细胞释放的外泌体,采用透射电镜(TEM)、纳米粒子跟踪分析(NTA)和Western blot对外泌体进行鉴定;qRT-PCR检测H.pylori诱导的胃癌细胞AGS源性外泌体中miR-382-5p表达;将miR-382-5p mimic转染至THP-1巨噬细胞,Western blot检测巨噬细胞自噬标志物LC3Ⅱ、P62、Beclin-1的表达,免疫荧光检测自噬小体数量;Western blot检测PTEN蛋白、其下游蛋白PI3K、AKT、mTOR及其磷酸化蛋白p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表达水平;流式细胞术检测巨噬细胞表型分子CD206和HLA-DR表达水平;ELISA检测巨噬细胞上清中细胞因子TNF-α、IL-6、IL-10和精氨酸酶1表达水平。结果:提取的外泌体符合外泌体形态,且高表达其表面标志蛋白CD9、CD63、TSG101;与空白对照组相比,H.pylori感染组AGS源性外泌体中miR-382-5p表达显著升高;miR-382-5p mimic转染导致巨噬细胞LC3、Beclin-1表达降低,P62表达升高,自噬小体数量降低;PTEN蛋白表达降低,p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表达明显增加。转染同时导致巨噬细胞M2型标志蛋白CD206表达增加,M1型标志蛋白HLA-DR表达降低;IL-10和精氨酸酶1表达增加,IL-6和TNF-α表达降低。抑制剂BEZ235预处理可部分逆转miR-382-5p对巨噬细胞自噬和极化的影响。结论:H.pylori诱导的胃癌细胞源性外泌体miR-382-5p通过靶向PTEN基因,激活PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制巨噬细胞自噬并促进其M2极化。

骨髓间充质干细胞来源外泌体的微小RNA-22-3p参与抑制环磷酰胺诱导卵巢颗粒细胞损伤的机制研究

目的分析骨髓间充质干细胞来源的外泌体微小RNA-22-3p(miR-22-3p)对卵巢早衰的影响。方法选取接受体外受精或者第二代试管婴儿治疗的卵巢早衰患者以及接受同样治疗的因男性因素不孕的正常志愿者提供卵泡液;通过差速离心法分离骨髓间充质干细胞来源外泌体;分离外泌体的形态学、粒子大小以及标志蛋白通过透射电子显微镜、NanoSight LM10分析仪以及蛋白免疫印迹方法进行分析。将颗粒细胞经环磷酰胺(CTX)、外泌体、miR-22-3p模拟物以及相应对照处理,分为CTX组、Control组、外泌体孵育组、PBS处理组、CTX+miR-22-3p组、CTX+miR-NC组、CTX+Exosomes组以及CTX+PBS组;采用蛋白免疫印迹法和定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)检测基因表达水平;利用二苯基四氮唑溴盐(MTT)试剂以及流式分析仪检测细胞活力和凋亡。结果提取的外泌体具有典型的杯状囊泡,外泌体标志蛋白簇状分化抗原63(CD63)和簇状分化抗原9(CD9)表达在所提取的细胞上清外泌体中,外泌体粒子大小为80~150 nm;miR-22-3p在卵巢早衰患者和CTX诱导的卵巢颗粒细胞中显著低表达(P<0.05),在骨髓间充质干细胞来源外泌体孵育卵巢颗粒细胞中显著高表达(P<0.05);颗粒细胞活力在CTX组低于对照组,但在CTX+miR-22-3p组或CTX+Exosomes组高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);颗粒细胞凋亡率在CTX组高于对照组,但在CTX+miR-22-3p组或CTX+Exosomes组低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论骨髓间充质干细胞来源的外泌体miR-22-3p抑制CTX诱导的卵巢颗粒细胞损伤。

膀胱癌患者尿液外泌体中miR-494-3p,LncRNA MAGI2-AS3表达水平及临床价值研究

目的探讨膀胱癌患者尿液外泌体中微小核糖核酸(microRNA,miR)-494-3p,长链非编码RNA(long noncoding RNA,LncRNA)MAGI2-反义RNA 3(MAGI2-antisense RNA 3,MAGI2-AS3)表达水平及临床应用价值。方法选取重庆两江新区第一人民医院2021年7月~2023年6月收治的105例膀胱癌患者为癌变组,另选取同期膀胱良性疾病患者101例作为良性组。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测尿液外泌体miR-494-3p和LncRNA MAGI2-AS3水平。Kappa检验分析尿液外泌体miR-494-3p和LncRNA MAGI2-AS3与病理活检诊断膀胱癌的一致性;受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析尿液外泌体miR-494-3p和LncRNA MAGI2-AS3水平对膀胱癌的诊断价值。结果癌变组尿液外泌体miR-494-3p水平(1.41±0.32)高于良性组(1.02±0.24),LncRNA MAGI2-AS3水平(0.79±0.19)低于良性组(1.05±0.22),差异具有统计学意义(t=9.866,9.089,均P<0.05)。miR-494-3p高表达组肿瘤直径>3 cm,T3~T4期以及淋巴结转移的占比显著高于miR-494-3p低表达组,差异具有统计学意义(χ^(2)=5.806,6.999,8.289,均P<0.05)。LncRNA MAGI2-AS3低表达组T3~T4期及发生淋巴结转移的比例明显高于LncRNA MAGI2-AS3高表达组,差异具有统计学意义(χ^(2)=9.244,7.795,均P<0.05)。尿液外泌体miR-494-3p和LncRNA MAGI2-AS3联合与病理活检诊断膀胱癌的一致性较高(Kappa值=0.718,P<0.05)。ROC曲线显示,尿液外泌体miR-494-3p和LncRNA MAGI2-AS3水平单独诊断膀胱癌的AUC(95%CI)分别为0.812(0.752~0.863)和0.779(0.716~0.833),尿液外泌体miR-494-3p和LncRNA MAGI2-AS3水平联合诊断膀胱癌的AUC(95%CI)[0.877,(0.824~0.918)]显著高于两者分别单独诊断(Z=2.053,2.647,P=0.040,0.008)。结论膀胱癌患者尿液外泌体中miR-494-3p水平升高,LncRNA MAGI2-AS3水平下降,二者联合对膀胱癌的诊断价值较高。

胸腔积液外泌体miR-506-3p联合腺苷脱氨酶检测在结核性胸膜炎的早期诊断及预后评估中的价值

目的 分析胸腔积液外泌体miR-506-3p联合腺苷脱氨酶(adenosine deaminase,ADA)在结核性胸膜炎的早期诊断及预后评估中的价值。方法 选取2021年8月至2023年3月就诊于沧州市人民医院的90例结核性胸膜炎患者作为结核组,另选同期于沧州市人民医院就诊的50例非结核性胸膜炎(肺炎旁胸腔积液、恶性胸腔积液等)患者作为非结核组,对比两组临床资料与胸腔积液外泌体miR-506-3p、ADA水平,经多因素Logistic回归分析影响结核性胸膜炎发生的危险因素。根据治疗3个月后患者预后情况,将结核组分为预后良好组(72例)、预后不良组(18例),对比两组胸腔积液外泌体miR-506-3p、ADA水平。经Pearson相关性分析,并绘制受试者操作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC曲线),分析胸腔积液外泌体miR-506-3p、ADA水平及二者联合预测结核性胸膜炎发生及患者预后的价值。结果 结核组患者胸腔积液ADA水平比非结核组高,胸腔积液外泌体miR-506-3p水平比非结核组低(P<0.05);经多因素Logistic回归分析发现,胸腔积液ADA水平高[OR=1.205(95%CI 1.105~1.313)]是结核性胸膜炎发生的危险因素(P<0.05),外泌体miR-506-3p水平高表达[OR=0.320(95%CI 0.158~0.658)]是结核性胸膜炎发生的保护因素(P<0.05);预后不良组患者胸腔积液ADA水平比预后良好组高,胸腔积液外泌体miR-506-3p水平比预后良好组低(P<0.05);绘制ROC曲线发现,胸腔积液ADA、外泌体miR-506-3p水平及二者联合预测结核性胸膜炎发生的曲线下面积(area under curve,AUC)为0.729(95%CI 0.640~0.818)、0.810(95%CI 0.738~0.883)、0.874(95%CI 0.818~0.930),预测结核性胸膜炎患者不良预后的AUC为0.892(95%CI 0.806~0.978)、0.924(95%CI 0.868~0.981)、0.942(95%CI 0.875~1.000);Pearson相关性显示,胸腔积液ADA与外泌体miR-506-3p水平呈负相关(r=-0.335,P=0.001)。结论 结核性胸膜炎患者胸腔积液外泌体miR-506-3p呈低表达、ADA呈高表达,二者之间为负相关,且miR-506-3p联合ADA可有效预测结核性胸膜炎患者不良预后的发生。

miR-141-5p/ZNF705A对慢性粒细胞白血病细胞源外泌体调控骨髓间充质干细胞黏附作用的机制

目的探讨慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)细胞源外泌体(exosome,Exo)中miR-141-5p/ZNF705A对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)黏附作用的影响。方法电镜和NTA粒径分析检测CML患者外周血和K562细胞中的Exo形态大小;qRT-PCR和Western blot检测转染前后K562细胞的Exo、BMSCs标记分子及黏附蛋白的表达情况;细胞黏附实验检测BMSCs的黏附能力;CCK-8法检测BMSCs活性、萤光素酶实验检测miR-141-5p与ZNF705A结合情况等。结果qRT-PCR结果显示,miR-141-5p表达在CML患者和K562细胞源Exo中均明显降低;qRT-PCR和Western blot等结果表明,CML患者中BMSCs的黏附蛋白CD44和CXCL12表达明显降低,且能够吞噬K562细胞源Exo。进一步发现,与CD34^(+)细胞相比,K562源性Exo能够降低Exo促进的BMSCs中CD44和CXCL12表达和黏附作用;同时,双萤光素酶基因报告等验证miR-141-5p与ZNF705A靶向结合;最后发现通过上调K562细胞源Exo中miR-141-5p的表达,靶向抑制ZNF705A,进而促进BMSCs的活性和黏附功能。结论K562细胞下调Exo中miR-141-5p表达,减少对ZNF705A的靶向抑制,进而抑制BMSCs的黏附功能,从而调控CML患者的骨髓造血功能。

miR-494-3p在胃癌患者血清外泌体中的表达及价值

目的探究微小RNA-494-3p(miR-494-3p)在胃癌患者血清外泌体中的表达水平及临床意义。方法采用TaqMan探针法RT-qPCR检测44例胃癌患者和44例健康人对照组血清外泌体中miR-494-3p的表达水平,采用ROC曲线分析并评估其对胃癌的鉴别诊断价值。同时,在14例胃癌组织和16例胃良性疾病对照患者胃组织中进行进一步验证。结果与健康人对照组(1.00±0.36)相比,胃癌组血清外泌体中miR-494-3p的相对表达水平(0.21±0.03)显著降低,差异有统计学意义(Z=3.64,P<0.01);胃癌组织中miR-494-3p的相对表达水平(0.22±0.07)亦显著低于胃良性疾病对照组(1.00±0.39),差异有统计学意义(Z=2.66,P<0.01)。血清外泌体miR-494-3p筛查胃癌和健康人的ROC曲线下面积(AUC ROC)为0.725(95%CI:0.622~0.829,P<0.01),当cut-off值为0.370时,其敏感性为50.0%,特异性为86.4%,阳性预测值为63.3%,阴性预测值为78.6%,准确性为68.2%。结论miR-494-3p在胃癌患者血清外泌体中呈低表达,有望成为胃癌筛查和辅助鉴别诊断的潜在生物学标志物。

骨髓间充质干细胞外泌体miR-126-3p靶向CCR1抑制非小细胞肺癌细胞恶性增殖及转移

目的探讨骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)来源的外泌体中miR-126-3p靶向趋化因子受体1(chemokine receptor 1,CCR1)对肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法培养BMSCs,提取外泌体并通过外泌体标志蛋白CD63和TSG101进行鉴定;外泌体共培养A549细胞不同时长(0、24、48、72 h)后,CCK-8检测细胞存活率,q RT-PCR检测miR-126-3p和CCR1 m RNA表达,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力;Western blotting检测CCR1、上皮钙黏蛋白(E-cadherin,E-cad)、神经钙黏蛋白(N-cadherin,N-cad)和波形蛋白(Vimentin)相对表达。结果外泌体呈边缘高亮、中间灰暗的圆形或椭圆形杯状结构,粒径分布范围152 nm左右,有CD63、TSG101蛋白表达;外泌体中miR-126-3p表达高于A549细胞,A549细胞中CCR1 m RNA表达高于外泌体,而在A549细胞与外泌体共培养后,A549细胞中miR-126-3p表达升高,CCR1表达降低;A549细胞与外泌体共培养0、24、48、72 h,细胞的存活率、迁移和侵袭能力和CCR1、N-cad和Vimentin蛋白表达及CCR1 m RNA表达均随着培养时间的延长逐渐降低,而miR-126-3p水平和E-cad蛋白表达随着培养时间的延长逐渐升高。结论BMSCs来源的外泌体与A549细胞共培养可提高细胞中miR-126-3p的表达,miR-126-3p通过靶向抑制CCR1表达可降低A549细胞增殖、迁移和侵袭能力。

血清外泌体miR-486-3p对非小细胞肺癌早期诊断价值

目的分析血清外泌体miR-486-3p对非小细胞肺癌的早期诊断价值。方法选择非小细胞肺癌病人120例为观察组,同期体检健康志愿者120例为对照组,均采集空腹静脉血,磷钨酸钠溶液染色后采用透射电镜观察外泌体形态,Western blot方法检测外泌体标志性蛋白CD81、TSG101表达,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测miR-486-3p水平,采用化学发光法检测血癌胚抗原(CEA)、糖类抗原125(CA125)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)水平,绘制受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析血清外泌体miR-486-3p诊断非小细胞肺癌的灵敏度和特异度。结果透射电镜观察可见,外泌体呈盘状囊泡样结构,直径为20~300 nm,颗粒状。Western blot实验鉴定表面标志蛋白CD81、TSG101证实为外泌体。观察组血清CEA、CA125、NSE、CYFRA21-1水平均高于对照组(t=10.701~31.406,P<0.01),miR-486-3p水平低于对照组(t=17.155,P<0.01);观察组高龄、男性、有淋巴转移病灶及TNM分期Ⅲ~Ⅳ期病人的miR-486-3p表达水平均低于中青年、女性、无淋巴转移性病灶及TNM分期Ⅰ~Ⅱ期病人(t=8.168~19.658,P<0.05)。ROC曲线分析显示,血清外泌体miR-486-3p诊断非小细胞肺癌的曲线下面积(AUC)为0.781,95%置信区间(CI)为0.724~0.839,灵敏度为51.67%,特异度为98.33%,最佳界值为0.945。结论血清外泌体miR-486-3p对非小细胞肺癌具有一定的早期诊断价值,血清外泌体miR-486-3p表达水平越低,非小细胞肺癌病人恶化程度越高。

肺癌细胞外泌体miR-24-3p调控CD8^(+)T细胞抗肿瘤的功能及机制研究

目的:探究肺癌细胞外泌体miR-24-3p调控CD8^(+)T细胞抗肿瘤的功能及机制。方法:将16HBE exo、A549 exo、H522 exo、H460 exo、miR-NC exo、miR-24-3p exo与CD8^(+)T细胞共孵育(16HBE exo组、A549 exo组、H522 exo组、H460 exo组、miR-NC exo组、miR-24-3p exo组),与PBS共孵育组(PBS组)作为对照,CD8^(+)T与miR-24-3p exo共孵育后转染FGF11质粒(miR-24-3p exo+FGF11组)。CCK8法检测CD8^(+)T细胞的增殖能力。双荧光素酶报告基因实验验证miR-24-3p和FGF11的靶向关系。将各组CD8^(+)T细胞与A549细胞以20∶1的比例共孵育4 h(16HBE exo/CD8^(+)T组、A549 exo/CD8^(+)T组、H522 exo/CD8^(+)T组、H460 exo/CD8^(+)T组、miR-NC exo/CD8^(+)T组、miR-24-3p exo/CD8^(+)T组、PBS/CD8^(+)T组、miR-24-3p exo+FGF11/CD8^(+)T组),Elisa检测共孵育后细胞上清中INF-γ和IL-2的浓度,LDH法检测CD8^(+)T细胞对A549细胞的杀伤能力。结果:相比于PBS组,A549 exo组、H522 exo组、H460 exo组CD8^(+)T细胞增殖能力显著降低(P<0.05)。A549 exo/CD8^(+)T组、H522 exo/CD8^(+)T组、H460 exo/CD8^(+)T组细胞上清中INF-γ和IL-2的浓度显著下降(P<0.001),CD8^(+)T细胞杀伤能力亦显著下降(P<0.001)。双荧光素报告基因检测结果显示FGF11为miR-24-3p的靶基因。miR-24-3p exo组CD8^(+)T细胞增殖能力显著低于miR-NC exo组,miR-24-3p exo+FGF11组CD8^(+)T细胞增殖能力显著高于miR-24-3p exo组(P<0.05)。miR-24-3p exo/CD8^(+)T组细胞上清中INF-γ和IL-2浓度及CD8^(+)T细胞杀伤能力均显著低于miR-NC exo/CD8^(+)T组(P<0.001), miR-24-3p exo+FGF11/CD8^(+)T组细胞上清中INF-γ和IL-2浓度及CD8^(+)T细胞杀伤能力显著高于miR-24-3p exo/CD8^(+)T组(P<0.001)。结论:肺癌细胞外泌体miR-24-3p可通过靶向抑制FGF11而抑制CD8^(+)T细胞的抗肿瘤功能。

缺氧肝细胞癌细胞来源外泌体miR-432-5p通过SOCS3/STAT3促进M2型巨噬细胞极化

目的探讨缺氧微环境下肝细胞癌(简称肝癌)细胞释放的外泌体对巨噬细胞极化的影响及其机制。方法通过免疫荧光染色、透射电镜、Western blotting明确缺氧对肝癌细胞外泌体释放的影响;通过流式细胞术、免疫荧光染色和实时定量PCR检测缺氧肝癌细胞来源外泌体对M2型巨噬细胞极化、免疫微环境的影响;通过免疫组织化学染色、免疫荧光染色、荧光素酶报告基因、Western blotting检测缺氧肝癌细胞来源外泌体miR-432-5p促进M2型巨噬细胞极化的机制。结果缺氧可促进肝癌细胞分泌外泌体,促进M2型巨噬细胞极化,其发挥作用的机制是外泌体中的miR-432-5p靶向SOCS3,调控SOCS3/STAT3信号通路实现的。结论缺氧肝癌细胞来源外泌体miR-432-5p介导的M2型巨噬细胞极化是通过SOCS3/STAT3信号通路实现的,这一信号通路为肝癌的靶向治疗提供了新方向。

模拟失重下微血管内皮细胞通过外泌体转运miR-223-3p抑制成骨细胞分化的研究

目的探究模拟失重下微血管内皮细胞通过外泌体转运miR-223-3p对成骨细胞分化的影响,为失重性骨质丢失的防治寻求干预靶点。方法利用2D回转器对小鼠微血管内皮细胞进行模拟失重处理,采用低温超高速离心法提取细胞培养上清中的外泌体,对外泌体进行鉴定及摄取实验;向MC3T3-E1细胞中转染mimic-223-3p、inhibitor-223-3p及相应的阴性对照进行功能验证;向外泌体中电转mimic-223-3p、inhibitor-223-3p及相应的阴性对照后与MC3T3-E1细胞共培养。采用qRT-PCR检测miR-223-3p及碱性磷酸酶(ALP)、Runx2、Ocn的mRNA表达变化;采用Western blotting检测Runx2、Ocn的蛋白表达变化;采用ALP活性检测和ALP染色方法检测成骨细胞分化能力的变化。结果模拟失重下微血管内皮细胞可分泌外泌体,外泌体与MC3T3-E1细胞共培养后,可被成骨细胞摄入并导致细胞中miR-223-3p表达升高(P<0.05);MC3T3-E1细胞分别转染mimic-223-3p、inhibitor-223-3p后,过表达miR-223-3p能够显著抑制成骨细胞分化(P<0.05,P<0.01),抑制miR-223-3p能够显著促进成骨细胞分化(P<0.05,P<0.01);Con Exos电转mimic-223-3p后与MC3T3-E1细胞共培养,可显著抑制成骨细胞分化(P<0.05,P<0.01);Clino Exos电转inhibitor-223-3p后与MC3T3-E1细胞共培养,可显著缓解模拟失重下微血管内皮细胞源外泌体对成骨细胞分化的抑制(P<0.05,P<0.01)。结论模拟失重下微血管内皮细胞可通过外泌体转运miR-223-3p,增加成骨细胞中miR-223-3p表达,进而抑制成骨细胞分化,提示miR-223-3p可以作为潜在的干预靶点。

胃癌患者癌组织和血清外泌体中LncRNA CCAT1、miR-140-3p表达及其临床意义

目的观察胃癌患者癌组织和血清外泌体中LncRNA结肠癌相关转录因子1(CCAT1)、微小核糖核酸-140-3p(miR-140-3p)表达情况并分析其临床意义。方法选取93例行胃癌根治术的胃癌患者为胃癌组,47例胃部良性病变患者为良性病变组,47例健康体检者为健康对照组。采集所有研究对象静脉血,提取血清外泌体,于胃癌患者行胃癌根治术过程中留取患者肿瘤组织样本及癌旁组织样本,采用RT-qPCR法检测血清外泌体及胃癌、癌旁组织中的LncRNA CCAT1、miR-140-3p。对胃癌患者随访5年,记录患者生存时间并计算5年生存率。采用Pearson相关分析法分析患者癌组织及血清外泌体中LncRNA CCAT1与miR-140-3p的相关性;比较不同病理特征胃癌患者癌组织及血清外泌体LncRNA CCAT1、miR-140-3p表达,以胃癌患者癌组织LncRNA CCAT1、miR-140-3p表达的平均值为界限,将患者分为高、低LncRNA CCAT1、miR-140-3p者,采用K-M生存曲线比较高、低LncRNA CCAT1、miR-140-3p患者5年总生存率;采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清外泌体LncRNA CCAT1、miR-140-3p对胃癌的诊断价值。结果患者胃癌组织LncRNA CCAT1表达高于癌旁组织,miR-140-3p表达低于癌旁组织(P均<0.05)。血清外泌体LncRNA CCAT1表达健康对照组<良性病变组<胃癌组,miR-140-3p表达健康对照组>良性病变组>胃癌组(P均<0.05)。Pearson相关分析显示,胃癌患者癌组织及血清外泌体中LncRNA CCAT1表达与miR-140-3p表达均呈负相关(r分别为-0.726、-0.639,P均<0.05)。不同肿瘤分化程度、浸润深度、临床分期及淋巴结转移情况的胃癌患者癌组织及血清外泌体中LncRNA CCAT1、miR-140-3p表达比较差异具有统计学意义(P均<0.05)。癌组织及血清外泌体LncRNA CCAT1高表达的胃癌患者5年总生存率低于LncRNA CCAT1低表达患者,miR-140-3p高表达的胃癌患者5年总生存率高于miR-140-3p低表达患者(P均<0.01)。ROC分析结果显示,血清外泌体LncRNA CCAT1、miR-140-3p预测胃癌的曲线下面积(AUC)分别为0.712、0.766,两者联合诊断胃癌的AUC为0.845。结论胃癌患者癌组织及血清外泌体中LncRNA CCAT1表达上调、miR-140-3p表达下调,其表达与患者肿瘤分化程度、浸润深度、临床分期及淋巴结转移情况及预后有关,血清外泌体LncRNA CCAT1、miR-140-3p联合对胃癌具有较高的诊断价值。

骨髓间充质干细胞外泌体源性miR-214-3p调控IKBKB基因促进宫颈癌细胞焦亡

目的探究骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMMSC)外泌体源性miR-214-3p调控B细胞κ轻肽基因增强子抑制因子激酶β(inhibitor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cell kinase beta,IKBKB)对宫颈癌细胞的影响。方法采用生物信息学方法分析宫颈癌组织中异常表达的微RNA,最终选择miR-214-3p作为目的基因,并确定其下游靶基因IKBKB;检测宫颈癌患者的癌组织及癌旁组织中miR-214-3p、IKBKB的表达情况;提取并鉴定BMMSC外泌体,干预外泌体中miR-214-3p的表达水平,构建IKBKB过表达质粒,将改造后的外泌体及质粒分别转染至宫颈癌HeLa细胞,测定转染后不同组别宫颈癌细胞焦亡相关指标。结果生物信息学和实验检测均发现miR-214-3p在宫颈癌组织和细胞中低表达,而在BMMSC外泌体中高表达,且BMMSC源性外泌体可显著提高宫颈癌细胞中miR-214-3p的表达水平;IKBKB基因是miR-214-3p的下游靶点,在宫颈癌组织和细胞中高表达;高表达miR-214-3p可促进宫颈癌细胞焦亡,过表达IKBKB基因后宫颈癌细胞的焦亡水平显著降低。结论BMMSC分泌的外泌体通过携带miR-214-3p调控IKBKB促进宫颈癌细胞焦亡。

结直肠癌组织和血清外泌体lncRNA PCGEM1、miR-152-3p的表达及其临床意义

目的:研究结直肠癌组织和血清外泌体长链非编码核糖核酸前列腺癌基因表达标记物1(lncRNA PCGEM1)、微小RNA-152-3p(miR-152-3p)的表达及其临床意义。方法:选取2020年1月至2021年10月南京医科大学附属无锡人民医院收治的138例结直肠癌患者作为结直肠癌组,另选取同期体检健康的90例健康人群作为健康组。检测血清外泌体、结直肠癌组织与癌旁组织中lncRNA PCGEM1、miR-152-3p相对表达量。分析结直肠癌组织、血清外泌体lncRNA PCGEM1、miR-152-3p表达与结直肠癌患者临床病理特征及预后的关系。Cox模型分析结直肠癌患者预后的影响因素。受试者工作特征(ROC)曲线分析lncRNA PCGEM1、miR-152-3p对结直肠癌的诊断价值。结果:结直肠癌组织、血清外泌体lncRNA PCGEM1相对表达量分别高于癌旁组织和健康组,miR-152-3p相对表达量均低于癌旁组织和健康组(P<0.05)。血清外泌体与癌组织中lncRNA PCGEM1、miR-152-3p表达与TNM分期、分化程度、浸润深度、淋巴结转移、远处转移有关(P<0.05)。LncRNA PCGEM1高表达组的生存率低于lncRNA PCGEM1低表达组,miR-152-3p低表达组生存率低于miR-152-3p高表达组(P<0.05)。血清外泌体lncRNA PCGEM1、miR-152-3p及分化程度、淋巴结转移、浸润深度是影响患者预后的因素(P<0.05)。血清外泌体lncRNA PCGEM1、miR-152-3p联合应用的曲线下面积(AUC)、灵敏度、特异度均较各指标单独应用明显提升(P<0.05)。结论:结直肠癌患者癌组织和血清外泌体中lncRNA PCGEM1表达上调、miR-152-3p表达下调,血清外泌体lncRNA PCGEM1、miR-152-3p联合诊断结直肠癌的效能更高。

miRNA-330-3p/Ap2m1轴在过表达GATA-4骨髓间充质干细胞外泌体抗心肌细胞凋亡中的作用

目的探讨过表达GATA-4小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)分泌外泌体(BMSC^(GATA-4)exosome)通过miRNA-330-3p/Ap2m1轴减少心肌细胞凋亡,提高心肌梗死心功能。方法建立小鼠心梗模型,共分7组,分别经尾静脉注射BMSC^(miRNA-330-3p-mimic)-exosome、BMSC^(miRNA-330-3p-inhibitor)-exosome、BMSC^(空载体)-exosome、BMSCexosome 48 h,同时将心梗未处理组及正常小鼠作为对照组。采用心脏彩超检测各组心功能,RT-PCR检测心梗心肌细胞内miRNA-330-3p的表达,Tunel法检测各组心梗心肌细胞凋亡数量。miRNA-330-3p对应靶基因Ap2.m1、Cnot4蛋白采用Western blot法进行检测。结果BMSC^(miRNA-330-3p-mimic)-exosome组心梗心功能改善最为明显(P<0.05),其心肌细胞内miRNA-330-3p表达量最高(P<0.05)。BMSC^(miRNA-330-3p-mimic)-exosome组心肌细胞的凋亡率最低(P<0.05),BMSC^(miRNA-330-3p-mimic)-exosome组心梗心肌细胞内的Ap2.m1的表达最低(P<0.05)。结论过表达GATA-4小鼠骨髓间充质干细胞外泌体通过miRNA-330-3p/Ap2m1轴抗心肌细胞凋亡。

外泌体hsa-miR-522-3p通过调节CDK6参与卵巢癌进程

目的:探讨外泌体hsa-miR-522-3p在卵巢癌发生发展中的作用及其潜在机制。方法:采用荧光实时定量PCR检测hsa-miR-522-3p在组织和细胞中的表达水平。使用EdU、Transwell和流式细胞术检测外泌体hsa-miR-522-3p对卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。通过荧光素酶测定和蛋白质印迹评估hsa-miR-522-3p对CDK6表达的调控作用。进一步构建裸鼠成瘤模型验证外泌体hsa-miR-522-3p对肿瘤生长的影响。结果:本研究发现hsa-miR-522-3p在卵巢癌组织、血浆外泌体及卵巢癌细胞的外泌体中表达显著升高。与NC组比较,hsa-miR-522-3p模拟物组细胞的迁移和侵袭能力显著增高且差异具有统计学意义(P<0.05)。此外,hsa-miR-522-3p抑制剂组可以促进caspase3和Bax的表达并抑制Bcl2的表达。荧光素酶报告结果显示,hsa-miR-522-3p能够靶向结合CDK6的3′-非翻译区(3′-UTR)来抑制其表达。裸鼠成瘤结果表明,外泌体hsa-miR-522-3p可增加瘤的体积及重量。结论:外泌体hsa-miR-522-3p通过调节CDK6参与卵巢癌的进程。本研究的发现将为外泌体hsa-miR-522-3p在卵巢癌发生中的机制提供新的见解。