外源报告基因EGFP在盐藻中实现瞬时表达

探索杜氏盐藻 (Dunaliellasalina)的转基因方法和筛选方法 .利用烟草花叶病毒启动子 (CaMV35S)、衣藻叶绿体atpA启动子与来源于水母的加强型绿色荧光蛋白报告基因 (EGFP)构建表达载体pART7GFP和pUCGFP ,转化盐藻 .EGFP在CaMV 35S启动下表达出绿色荧光蛋白 ,在荧光显微镜下看到发绿色荧光的转基因盐藻 .根据荧光数目进行统计 ,转化效率高于 5 % .衣藻来源的启动子atpA在盐藻中未能启动EGFP的表达 .用直径 1μm的金粉颗粒和 0 6 μm的金粉进行基因枪法转化 ,1μm的金粉颗粒成功将外源基因导入盐藻 ,用 0 6 μm的金粉配合多种技术参数也没有将外源基因导入盐藻 .EGFP可以用作盐藻遗传转化的报告基因使单细胞真核生物盐藻可以利用流式细胞术 (FACS)等技术进行筛选 ,从而避开平板筛选转基因盐藻的限制 。

GFP为外源报告基因在地衣芽孢杆菌20386中表达的研究

目的 探讨外源基因在野生型地衣芽孢杆菌 2 0 386中表达的可行性。方法 利用大肠杆菌 枯草芽孢杆菌穿梭表达载体在大肠杆菌DH5α中构建含绿色荧光蛋白 (GFP)基因的重组质粒 ,通过电转化将重组质粒转入到野生型地衣芽孢杆菌 2 0 386中表达 ,通过检测绿色荧光蛋白的存在 ,考察该野生型菌株表达外源基因的可能性和表达能力。结果 在紫外光激发下 ,在固体LB平板上生长的菌落能显示绿色荧光 ,而在液体LB培养基中培养的菌体和培养上清中未能检测到绿色荧光蛋白的存在。结论 外源基因在野生型地衣芽孢杆菌 2 0 386中能够表达 ,但在液体LB中培养时 ,可能会被该菌自身分泌的蛋白酶分解 ;亦可能被稀释而无法测到荧光 。

外源基因Egfp在转基因小鼠中的遗传和表达稳定性研究

本实验随机抽取不同窝的纯合绿色荧光蛋白(EGFP)转基因小鼠子代进行检测,分别取其尾部组织,提取DNA,质量检测,PCR扩增。经研究发现所有样本在PCR扩增中显示目的条带,对其进行切胶回收纯化,连接转化及克隆测序。测序结果100%匹配且测序峰图的趋势正常。随后对这些转基因小鼠尾组织样本进行定量实验,检测其外源基因Egfp的表达情况,结果发现有一部分小鼠的mRNA表达水平较低。得出的结论是外源基因Egfp稳定地遗传给了后代但在部分后代个体中不能稳定有效表达。本研究通过对外源基因Egfp遗传和表达稳定性的检测,为通过转基因技术培育家畜新品种的研究提供了坚实的理论基础。

不同组成型启动子对乳酸菌表达系统外源基因表达影响的比较

【目的】构建不同组成型启动子的乳酸菌表达载体系统,评价不同启动子驱动外源基因表达的活性,筛选出强表达的启动子,为后续研究乳酸菌作为活菌载体表达外源抗原或功能性蛋白提供理论依据。【方法】以大肠杆菌-乳酸菌穿梭载体pPG为骨架,将表达载体中启动子序列分别替换为组成型强启动子Pldh、PHH和Phce,利用PCR方法扩增报告基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和氨苄青霉素抗性基因(Ampr),并在下游多克隆位点中分别插入荧光素酶(LUC)、EGFP和Ampr报告基因,构建9种乳酸菌表达质粒,电转入副干酪乳杆菌HLJ-27感受态细胞,筛选获得9株重组乳酸菌。通过实时荧光定量PCR检测报告基因在重组菌中的mRNA转录水平,利用Western blotting和间接ELISA检测蛋白的表达量,并检测表达蛋白的活性,以评估3个启动子的活性强弱。【结果】PCR成功扩增出大小约720 bp的EGFP基因和850 bp的Ampr基因。Western blotting结果显示,在9株重组乳酸菌中,分别成功表达出了58 ku的LUC蛋白、26 ku的EGFP蛋白和28 ku的Ampr蛋白。实时荧光定量PCR和间接ELISA检测结果显示,启动子Pldh启动外源基因转录水平和驱动外源蛋白表达水平均显著高于启动子PHH和Phce(P<0.05;P<0.01)。报告基因检测结果显示,启动子Pldh驱动LUC、EGFP和Ampr外源蛋白的活性显著高于启动子PHH和Phce(P<0.05;P<0.01)。【结论】本研究成功构建了3种启动子报告基因表达系统,确定了3种启动子活性强弱依次为Pldh、PHH和Phce,探究出一种启动子活性筛选的优势筛选系统——Ampr报告系统,为高表达乳酸菌载体系统的建立提供了必要的依据。

eGfp/Gus融合基因植物表达载体的构建和转化验证

绿色荧光蛋白(Gfp)基因和葡萄糖醛酸糖苷酶(Gus)基因是广泛应用的2个报告基因,在定性和定量研究基因表达和启动子功能等方面各有优劣。为联合使用这2个报告基因,根据报告基因序列设计2对带有特异限制性内切酶位点的引物,PCR法分别扩增增强型Gfp(eGfp)和Gus基因,连接到植物表达载体pF-GC5941中,构建含CaMV35S启动子驱动的eGfp/Gus基因融合表达载体,命名为pFGC-DR。注射农杆菌法转化烟草叶片,以及花器官农杆菌浸泡法转化拟南芥,发现融合基因成功地在烟草叶片中瞬时表达和在拟南芥中稳定表达,表明融合报告基因在烟草和拟南芥中都能高效表达。

叶片衰老诱导FLP重组酶删除转基因烟草外源基因的研究

【目的】"Gene-deletor"系统可实现转基因植物中外源基因的清除。为了研究该系统在转基因烟草中对清除外源基因的作用并最终创制不含外源基因的烟草新种质。【方法】以含有"Gene-deletor"系统的转基因烟株为材料,分析外源筛合报告选融基因Bar::GUS、重组酶基因FLP在不同叶龄叶片中的表达水平,同时通过观察转基因烟草花粉中GUS蛋白的表达活性,分析外源基因GUS在花粉中的删除情况。【结果】(1)相同叶龄不同转基因烟株叶片均表现出GUS活性和对除草剂草铵膦抗性,且3个转基因烟草株系中GUS活性和对除草剂抗性都表现出随着叶龄增大而降低的特点。(2)Real-time PCR和RT-PCR结果进一步证明外源Bar::GUS基因表达水平随叶片发育成熟持续下降,而外源FLP基因的表达水平则出现先增后降的变化趋势,在测定后期两者的表达量均达到最低,(3)花粉GUS组织染色结果表明,"明,色结果降的变化趋势,特系统诱导各转基因植株中花粉外源基因清除效率不同,平均清除率分别78.3%,54.7%和75.2%。【结论】在转基因烟草中,叶片衰老特异表达基因SAG12基因启动子驱动"动启动子驱动达基因,平均清系统(LoxP/FRT)的表达不仅可引起转基因植株叶片中外源基因的特异性清除,还能诱导花粉中外源基因的删除,该技术可为进一步创制培育不含外源基因的烟草新种质提供参考。

hAPG12-EGFP融合基因真核表达载体的构建及其在酵母中的表达

目的本研究旨在构建大肠杆菌-酿酒酵母真核表达载体pESC-URA-EGFP-hAPG12,并将构建好的载体转化到酵母。方法从pEGFP-C2中扩增出增强绿色荧光蛋白EGFP基因,定向亚克隆到真核表达载体pESC-URA;hAPG12插入到EGFP基因氨基末端;构建的载体转化到酵母。结果EGFP和hAPG12基因正确亚克隆到pESC-URA中,EGFP-hAPG12融合蛋白在酵母中表达。结论构建了具有报告基因及hAPG12的重组真核表达载体pESC-URA-EGFP-hAPG12。

一个新的重组酶系统在转基因植物外源基因删除中的应用

为了解决转基因植物可能带来的生物安全性问题,设计了一个新的位点特异性重组酶系统pLFHFGN,该系统中重组酶FLP基因由热激蛋白Hsp18.2基因的启动子控制,所有外源基因(包括重组酶基因FLP、GUS报告基因和NPTII筛选标记基因)都置于两个融合识别位点loxFRT之间.将上述重组酶系统通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化烟草,获得的再生植株分别通过GUS组织染色和PCR分析等方法进行鉴定.然后在37℃下热激处理转基因植株,利用GUS组织染色检测重组酶系统在转基因植株T1代幼苗中删除外源基因的效率,结果显示,该系统删除效率达到了48.2%～84.9%,说明通过重组酶系统pLFHFGN能够有效地删除转基因植物中的外源基因,这为解决转基因植物潜在的安全性问题提供了一条新的途径.

外源基因在转基因禾谷类作物中的表达

最近由于转化技术的长足进步,已在越来越多的禾谷类作物中培育出转基因植株。为了借助基因工程改良禾谷类作物的品质及其它农艺性状,目前的重点已开始放在那些能调控外源基因在转基因禾谷类作物中表达的分子元件的鉴定上。 禾谷类作物包括一大群具有经济价值的植物种,如果引入一些控制优良品质及其它农艺性状如抗病性和抗逆性的外源基因,并让其表达,那么这些作物对人类的价值会更高。然而。

基因导入的脂质体转染法和磷酸钙转染法之比较

将外源基因导入真核细胞的方法很多。我们通过对绿色荧光蛋白 (GFP)报告基因在真核细胞中表达的研究 ,比较了较常用的两种方法—脂质体转染法和磷酸钙转染法。研究结果表明 :脂质体转染法的转染效率较磷酸钙转染法高 ,且简单易行 ,是外源基因导入体外培养细胞内较理想的方法。

Egfp标记对菌株降解活性与存活能力影响研究

以蒽为惟一碳源，着重探讨了egfp基因标记对外源降解菌降毹活性和环境竞争能力的影响，研究了石油化工厂污水中存在的混合菌群对外源降解菌的影响。结果表明，egfp基因标记对宿主细胞ETAN1315降解蒽的活性有所降低，但影响甚微，标记菌株仍可用于含蒽废水的处理．EGFP可以作为一种活体指示物，跟踪并实时掌握外源降解菌的生长和运动情况。实验室分离的外源降解菌包括标记的和未标记的，对蒽都具有高效降解活性。与土著混合菌群相比较，外源降解菌显示了环境竞争优势。

含EGFP的人BMP2表达载体在人皮肤成纤维细胞中的表达

目的构建带加强型绿色荧光蛋白 (EGFP)基因的人骨形成蛋白 2 (hBMP2 )真核表达载体 ,观察其在正常人皮肤成纤维细胞中的表达情况。方法构建携带hBMP2和EGFP基因的真核表达载体 pcDNA3 hBMP2 IRES EGFP(pcBE) ,将其转染NIH3T3细胞和正常人皮肤成纤维细胞后 ,采用RT PCR和免疫组化染色方法分别检测人BMP2和EGFP基因在mRNA和蛋白质水平上的表达情况。结果转染后的NIH3T3和正常人皮肤成纤维细胞均能转录人BMP2mRNA和表达人BMP2蛋白 ,同时显示绿色荧光。结论 pcBE真核表达载体可在正常人皮肤成纤维细胞内有效表达人BMP2蛋白 ,并以其荧光报告基因起示踪作用。

转基因蚕研究现状

自从Palmiter等用小鼠金属硫蛋白-1基因融合大鼠生长激素基因显微注射入小鼠受精卵原核中,获得了“超级小鼠”,并提出可以从转基因动物中获取有价值的蛋白质以来,转基因生物的研究发展迅速.利用转基因技术,我们既可以加快农作物和家畜品种改良,又可以生产珍贵药用蛋白,为遗传病患者造福.家蚕是最重要的经济昆虫之一,对世界经济文化的发展作出过重大的贡献.随着近年来生命科学和生物技术的飞速发展,家蚕分子生物学基础研究和应用研究也取得了可喜的业绩,在转基因蚕的研究上更是方兴未艾,以下对此做一叙述.

稳定表达eGFP-戊型肝炎病毒复制子的建立及体内外特征

戊型肝炎病毒(HEV)是急性病毒性肝炎的主要病原体.为了寻找有效的HEV研究工具,利用反向遗传学构建了携带绿色荧光蛋白(eGFP)的重组HEV感染性克隆——eGFP-HEV.eGFP-HEV转染Huh7.5.1细胞后,在荧光显微镜下能够直接观察到荧光信号,可以实时追踪HEV的复制情况,将eGFP-HEV的子代病毒粒子接种细胞,利用免疫荧光和qRT-PCR验证了其传染性.eGFP-HEV细胞培养系统可以通过直接观察绿色荧光信号来评价药物的抗病毒效果,为HEV药物筛选提供了重要工具.此外,在接种eGFP-HEV的BALB/c裸鼠的胆汁和粪便中也可追踪到eGFP-HEV的绿色荧光信号.值得注意的是,感染小鼠肝脏中表达的HEV抗原量与eGFP的荧光强度高度匹配,可以利用eGFP的荧光信号代表HEV的病毒滴度.携带绿色荧光蛋白的eGFP-HEV感染性克隆在体内、外的成功表达将加快HEV的研究,有利于抗HEV药物或疫苗的研发.

一种简便高效的人胚胎干细胞转染方法

目的 :利用Fugene 6基因转染试剂建立一种简便高效的人胚胎干细胞转染方法 ,并建立稳定表达增强型绿色荧光蛋白 (enhancedgreenfluorescentprotein ,EGFP)报告基因的人胚胎干细胞系 ,为人胚胎干细胞研究提供一个非常有用的细胞模型。方法 :通过Fugene 6基因转染试剂成功地将EGFP基因转入无饲养层培养的人胚胎干细胞中 ,嘌呤霉素筛选得到稳定表达EGFP的克隆 ;利用倒置荧光显微镜和流式细胞仪检测EGFP在人胚胎干细胞中的表达情况。结果 :EGFP瞬时转染效率为 30 %～ 40 % ,稳定转染效率约 1 1 0 4～ 5,且稳定转染的人胚胎干细胞均表达EGFP。结论 :Fugene 6是一种良好的基因转染试剂 ,它可以有效地将外源基因转入人胚胎干细胞中 ,为人胚胎干细胞的转基因研究提供新的实验手段。

月季的植株再生及遗传转化研究进展

本文对近20年月季植株再生和转基因研究进展进行了较为系统的回顾和总结。月季通过器官和体细胞胚发生途径都能再生植株,但遗传转化主要是利用体细胞胚发生途径。通过农杆菌介导法和基因枪法,外源基因如报告基因、抗病基因和改变花色的基因等已转化成功。文章还对今后月季转基因研究的方向进行了讨论。

新城疫病毒作为疫苗载体的研究进展

在综述新城疫病毒(NDV) 的分子生物学特征、致病本质、复制机理以及利用反向遗传操作技术获得NDV的感染性克隆的基础上,着重介绍了以NDV作载体,将报告基因、功能基因包括鸡传染性法氏囊病毒VP2基因及流感病毒HA基因等插入NDV基因组的不同位置构建重组新城疫病毒,并对外源基因进行成功表达的研究进展。同时对DNV作为新的疫苗载体表达外源基因的可行性及未来应用前景进行了初探。

含人P21启动子双荧光素酶基因载体的构建

目的构建带有EGFP标记含人P21启动子的双荧光素酶报告基因载体。方法从人血白细胞DNA中克隆P21启动子,用于控制firefly荧光素酶的表达;renilla荧光素酶基因和EGFP基因用IRES连接,在CMV启动子控制下表达;上述元件和基因克隆至载体pLL3.7中,应用酶切和测序的方法进行鉴定正确后转染至293FT细胞观察EGFP表达。结果经酶切、测序证实成功构建了带有EGFP标记的含人P21启动子的双荧光素酶报告基因的载体,并成功表达EGFP。结论含人P21启动子的双荧光素酶报告基因的载体成功构建,为下一步的药物筛选打下基础。

可调控的肝癌特异性基因治疗载体的构建

目的 构建新型AFP顺式作用元件调控的基因表达载体 ,检测该调控元件的特异性和可调控性。方法 PCR扩增截短的AFP基因启动子、增强子 ,将上述片段与含有报告基因强化绿色荧光蛋白基因的载体pEGFP 1的多克隆位点连接 ,构建成为AFP基因顺式作用元件调控的肝癌特异性EGFP表达载体 (pEGFP 1 EP)。用脂质体法将表达载体转染表达或不表达AFP的肿瘤细胞系 ,荧光显微镜观测重组AFP顺式作用元件的启动活性 ,并用流式细胞术检测全反式视黄酸对它的抑制作用。结果 成功地将AFP基因启动子、增强子克隆到报告基因载体pEGFP 1的多克隆位点 ,酶切鉴定和DNA序列分析无误 ,荧光显微镜观测证实EGFP能在AFP阳性肝癌细胞特异性表达 ,1× 10 -7M全反式视黄酸对其活性有明显的抑制。结论 AFP顺式作用元件修饰的基因治疗载体 ,在基因转录水平特异性调控目的基因的表达 ,为下一步将其作为肝癌基因治疗载体奠定了基础。