地鼠肾原代细胞外源病毒调查

清洁级、普通级2周龄地鼠，按卫生部颁布的无特异病原体（SPF）级的标准李行病毒抗体检测均为阴性。但8批用清洁级地鼠制备的肾原代细胞中均未发现有血吸附现象，而在普通级，血吸附阳性率高达86％（18／21）。超离浓缩后血凝效价达1：4～1：64；负染后用电镜可观察到副流感样病毒颗粒。经血清学检测，该外源病毒与仙台和小鼠肺炎病毒抗原相关，但按常规方法不易在鸡胚和同种地鼠肾细胞上传代。

部分禽源生物制品外源病毒的检测

进行了部分禽用生物制品外源病毒检测的鸡胚检查法、细胞检查法和鸡检查法。鸡胚检查法应用SPF鸡胚检验;细胞检查法主要通过鸡红细胞吸附试验、禽白血病病毒ELISA和禽网状内皮组织增生症病毒IFA检验疫苗是否含有外源鸡红细胞吸附因子、禽白血病病毒和禽网状内皮组织增生症病毒,并提出疫苗检验的判定标准,为各兽用生物制品生产企业新城疫疫苗的外源病毒检验提供参考。

病毒类疫苗中外源病毒污染、检测方法与控制措施

就疫苗中污染外源病毒的情况、外源病毒传统检测技术及新型分子检测技术等进行了综述,并提出通过严格按照GMP规范组织生产,加强对菌(种)毒和细胞库的质量控制,严格控制生产检验原材料质量,进一步完善标准方法、提高检验水平,开展外源因子风险评估研究等措施以降低污染风险。

疫苗制备中外源病毒检测方法

疫苗安全性是公众及药品监管机构非常关注的问题。由于疫苗生产原材料如组织、细胞基质、血清、胰蛋白酶等来源于动物,因此疫苗产品存在外源病毒污染的风险。外源病毒对人有潜在危害,实施系统性的检测和采取严格的预防措施可以有效降低外源性因子污染的风险。几十年来,某些经典的检测法已经成为广谱筛查外源病毒污染的标准方法,但其存在一定的局限性。随着大规模基因并行测序、微阵列等分子生物学检测新方法的建立,疫苗外源因子检测方法日趋多样化,增加了检测疫苗外源因子污染种类和概率。

禽用活疫苗外源病毒污染情况的调查研究

为对禽用活疫苗污染外源病毒的情况进行彻底摸底调查,抽取了目前使用量大、覆盖面广的禽用活疫苗重点品种共8种28批,涉及18家国内生产企业、7家国外企业,疫苗生产用SPF鸡胚来自国内8家企业。按照《中国兽药典》2010年版三部鸡检查法和《欧洲药典》对抽检的禽病活疫苗进行了外源病毒污染和禽腺病毒污染检验。结果显示所抽检的禽用活疫苗均无外源病毒污染和禽腺病毒污染,表明我国禽用活疫苗的质量控制和安全性良好。

《中华人民共和国兽药典》二○一○年版三部非禽源细胞及其制品外源病毒检验解读

对《中华人民共和国兽药典》二○一○年版三部中"非禽源细胞及其制品外源病毒检验"新变化和关键点进行了解读,为规范和完善非禽源外源病毒检验提供了参考。

电镜技术检验犬四联弱毒苗种子毒及成品的外源病毒

我们用电子显微镜（电镜）技术，检验犬四联弱毒疫苗种子毒及其成品疫苗中的外源毒。经对每批种子毒细胞培养物及间隔一定批次成品疫苗抽样检查，其中在一批种子毒细胞培养物中发现了呼肠病毒污染，得到及时有效的处理。同时证明应用电镜技术检验外源病毒确是一种快速而有效的方法。

禽用病毒性活疫苗外源病毒污染现状

1国内SPF鸡群微生物学监测 1．1现状 检测项目不全，缺少禽肾炎病毒、禽鼻气管炎病毒、禽轮状病毒、禽结核、腺病毒Ⅱ群、沙门菌其它种、禽副黏病毒2型和3型及不同血清型传染性支气管炎病毒等；检测标准、方法不完善；检测试剂质量不稳定，国外试剂进口困难等；检测技术、检测频率不一致；多数生产企业未通过认证认可和行业主管部门的认证。

地鼠肾原代细胞外源病毒调查

清洁级、普通级２围龄地鼠按卫生部颁布ＳＰＦ级要求进行血清病毒抗体检测结果均为阴性，但所制备肾原代细胞血吸附试验结果有明显差异：清洁级中没有发现有血吸附现象，而普通级血吸附阳性率高达８６％（１８／２１）．超离浓缩后可测得血凝１：４～１：６４．负染电镜观察到副流感样病毒颗粒。血清学调查，血凝及血吸附抑制试验结果表明与仙台和小鼠肺炎病毒有关，该外源病毒不易按常规方法在鸡胚和同种地鼠肾细胞上传代。

不同处理方式对外源病毒检测中FAdV-I检出限量的影响

据报道Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-I)在禽活疫苗中的污染是其可能的传播途径之一,加强对活疫苗中FAdV-I检测至关重要。为探索建立FAdV-I检测标准,本研究参照《中华人民共和国兽药典》中外源病毒检测相关疫苗处理措施,对不同方式处理后FAdV-I检测的影响进行了摸索。结果显示:当离心力不大于8000×g时,4℃离心10 min不会引起FAdV-I病毒含量下降,10000×g和12000×g分别离心10 min,病毒含量分别下降50%和68%,8000×g离心后再经0.45、0.22μm滤膜各滤过一次,病毒含量下降68%;8000×g离心后0.45、0.22、0.1μm滤膜各滤过1次后,病毒含量下降90%,12000×g离心后0.45、0.22、0.1μm滤膜各滤过1次后,病毒含量下降95%;SPF鸡血清及检验中常用的抗血清中和疫苗过程中在4℃或37℃作用1 h均不会引起FAdV-I病毒含量降低。上述指标为疫苗中FAdV-I污染的检测方法建立提供了参考数据。

禽网状内皮组织增生症病毒单抗制备及在外源病毒检测中的应用

将禽网状内皮组织增生症病毒(REV)囊膜蛋白gp90(SU)的基因合成后连接至原核表达载体中进行表达,获得REV-SU蛋白,通过Ni柱亲和层析获得纯化的重组蛋白,免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术获得1株分泌特异性抗REV-SU蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞系(2A2株),该细胞株制备的腹水与不同REV毒株具有良好的反应性,荧光效价可达1∶51200,与不同禽白血病病毒毒株和其他常见禽的病原均没有交叉反应,特异性良好。应用该单克隆抗体建立的间接免疫荧光法能检出至少5 TCID_(50)REV感染,与多克隆抗体作为检测一抗具有同等的效力,且检测背景更加纯净,适用于外源性REV检验。

鸭瘟活疫苗外源病毒检验方法(鸡检查法)的修订

对二〇〇五年版《中华人民共和国兽药典》中鸭瘟活疫苗外源病毒检验的鸡检查法进行了修订,确定选用9～12周龄SPF鸡,在原药典规定方法的基础上增加低剂量基础免疫程序,并用该外源病毒检验方法对5批鸭瘟活疫苗进行了验证,结果表明修订后的鸭瘟活疫苗外源病毒检验方法可靠,可操作性强。

猪蓝耳病活疫苗中猪瘟外源病毒检测

试验采用IFA法对2批随机抽样的PRRS活疫苗(每批4瓶)、阳性对照(CSFV)、阴性对照(未被CSFV污染的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV))和特异性试验检测病毒(猪圆环病毒2型(porcine circo virus 2 type,PCV-2))接种于生长良好的PK-15细胞进行间接免疫荧光染色检测CSFV,以期建立快速、准确的间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay,IFA)调查猪蓝耳病活疫苗中猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)的污染情况;在不同时间、相同试验条件下,相同批次的疫苗被重复检测了3次。试验结果表明:阳性对照接种的PK-15细胞出现特异性黄绿色荧光,阴性对照、PCV-2和待检样品接种的PK-15细胞均未出现特异性黄绿色荧光,即待检2批PRRS活疫苗未被CSFV污染;通过3次重复操作,最终的检测结果一致,说明IFA检测猪瘟病毒包涵体的特异性强、敏感性高。

禽用生物制品外源病原监测研究──传染性支气管炎疫苗外源病毒检测

６４倍稀释的抗ＩＢＶ（传染性支气管炎病毒）高免血清可中和１００个ＥＩＤ＿（５０）ＩＢＶ病毒；２倍稀释抗ＩＢＶ高免血清可中和１０个羽份ＩＢＶＨ５２病毒。用ＮＤＶ（鸡新城疫病毒）ＬａＳｏｔａ或Ⅰ系病毒模拟污染ＩＢＶＨ５２毒株后，再用抗ＩＢＶ高免血清中和，可以检出污染的病毒。抽检ＩＢＶＨ１２０疫苗的１０个羽份可被ＩＢＶ高免血清中和。

二代测序技术检测生物制品中外源病毒的技术方法和应用进展

生物制品中外源病毒污染一直是监管机构对其安全性评价的重要内容,目前主要采用的技术包括体外细胞培养、接种动物、种属特异性检查等传统方法,但是传统方法普遍存在灵敏度低、检测范围窄等缺点,因此有些病毒可能无法检出。二代测序法(Next Generation Sequencing,NGS)曾被用于发现已获批上市的疫苗中存在外源病毒污染,说明该法具有全面检测病毒的潜力。使用NGS法检测外源病毒,能从源头上保障生物制品的安全。然而,生物制品中的病毒含量可能很低,甚至还可能和已知病毒的基因序列存在较大差异,NGS法能否全面准确地检出病毒尚不清楚;而且,NGS是一项复杂的技术,在操作流程和数据解读方法等方面尚无任何指导原则。本文首先回顾了世界范围内的主要药品生产企业和监管机构对NGS技术检测生物制品中外源病毒的观点,接着详细讨论了该方法的技术流程和将方法标准化时面临的挑战,最后陈述了部分NGS技术检测生物制品中外源病毒的应用实例,为利用NGS技术检测生物制品中外源病毒方法的建立、标准化和验证提供启示。

禽用生物制品外源病毒监测研究──鸡传染性法氏囊炎疫苗外源病毒检测

原倍鸡传染性法氏囊炎（ＩＢＤ）高免血清可以中和１０个羽份ＩＢＤ病毒；中和后的病毒接种鸡胚卵黄囊后继续孵化至出雏，雏鸡健活；用ＮＤＶＬａＳｏｔａ毒和鸡鹌鹑痘病毒模拟污染ＩＢＤＶＢ８７毒再经ＩＢＤ高免血清中和，可以检出模拟污染的病毒；高免血清可以中和１０个羽份的ＩＢＤ疫苗毒。

SPF种蛋四种蛋传外源病毒抗体检测技术标准研究

SPF鸡即无特定病原鸡，一般指饲养于可控环境中，不能检出国际、国内流行的鸡主要传染病的病原（我国规定19种病原体，欧盟18种，美国16种），具有良好的生活力和繁殖性能的鸡群。其所产的受精卵即为SPF种蛋。SPF鸡及SPF种蛋因其微生物学上的相对纯净性而成为病毒学、营养学、病理学研究及生物制品生产、检验中不可缺少的标准实验动物和实验材料。

猪瘟脾淋毒活疫苗中兔瘟外源病毒检测方法的建立及应用

为检测商品化猪瘟脾淋毒活疫苗中RHDV污染,根据兔出血症病毒VP60基因保守序列设计引物,建立了检测兔出血症病毒一步法反转录一聚合酶链（RT-PCR）方法,并对其特异性、敏感性进行了研究。该一步法RT-PCR对RHDV扩增结果为阳性,对照毒株扩增结果均为阴性;对兔出血症病毒检测的灵敏性为10皮克总RNA量,应用该方法,检测了20批猪瘟脾淋源活疫苗样品。

猪瘟活疫苗外源病毒BVDV细胞培养与PCR检测的比较

采用细胞培养法和PCR方法,一次性对中股份江西生物药厂生产的18批猪瘟活疫苗(细胞源)进行了外源病毒BVDV(牛病毒性腹泻病毒)两种方法的检测,并进行了比较。结果显示:细胞检验外源病毒方法除了能用荧光抗体检测BVDV外,还能通过致细胞病变检查和红细胞吸附试验检测蓝舌病毒、细小病毒等其它外源病毒;而PCR方法检测的是病毒核酸,并不能鉴别病毒活性,另外,由于PCR灵敏度高,容易出现假阳性,如果不对DNA测序,可能出现假阳性而导致结果误判,给生产企业造成巨大的经济损失。

影响非禽源外源病毒检验的主要因素

本文以《中华人民共和国兽药典》2015版三部非禽源外源病毒检验方法为依据,总结了检测过程中细胞状态、样品处理、接种与继代培养、荧光抗体检查等对外源病毒检验的影响,为企业提高外源病毒检验的准确度和检出率提供参考。