p53反义RNA对人肺癌细胞表型和顺铂敏感性的影响

目的 研究外源p53反义RNA对有p53基因 2 4 8密码点突变的人肺癌细胞系恶性表型和顺铂敏感性的影响。方法 构建p53反义RNA真核细胞表达载体PEGFP p53(AS) ,经酶切图证明反向联结质粒。Lipofectin介导转染有p53基因 2 4 8密码点突变的人肺癌细胞系 80 1D ,经G41 8筛选获耐受克隆。稀释法建立单细胞克隆系 ,应用PCR检测外源基因 ,荧光显微镜检测细胞绿色荧光蛋白表达 ,p53单抗免疫组化染色检测p53突变蛋白表达 ,体外集落形成实验检测细胞生长 ,流式细胞仪检测细胞周期 ,MTT法检测细胞对顺铂药物敏感性。结果 酶切图证明了p53 cDNA反向联结于质粒 ,构建了PEGFP p53(AS) ,并建立了转染单细胞克隆系PEGFP p53(AS) 80 1D及空载细胞系PEGFP 80 1D。PCR检测外源p53基因和neo基因存在于转染细胞系 ,而荧光显微镜下发现其胞浆有绿荧光蛋白表达。免疫组化染色p53突变蛋白在 80 1D细胞系为阳性 ,而PEGFP p53(AS) 80 1D为阴性 ,证明外源反义p53在转染细胞稳定表达并封闭内源突变蛋白表达。与母系相比 ,PEG FP p53(AS) 80 1D集落形成抑制率为 61 % (P <0 .0 1 ) ,流式细胞仪检测该细胞系G1期细胞数明显增加 ,出现G1期阻滞的表现。MTT检测PEGFP p53(AS) 80 1D对顺铂比母系更为敏感。结论 有p53基因 2 4 8密码点?

P53反义RNA抑制肝癌生长的研究

目的 :研究P5 3反义RNA对肝癌细胞中突变型P5 3致癌性的抑制效应 ,为肝细胞癌基因治疗提供新的方法。方法 :2 .1的人全长cDNA用EcorRⅠ和XbaⅠ的双酶切得到 16 94bp长cDNA片段 ,反向插入哺乳动物表达载体PCR3.1,得到P5 3反义表达载体PCR3.1-P5 3(AS) ,并将其导入人肝细胞株Bel- 74 0 2 (内源性突变型P5 3) ,采用MTT法和FCM方法测定PCR3.1-P5 3(AS)表达的P5 3反义RNA对Bel- 74 0 2细胞生长的影响。结果 :带有PCR3.1-P5 3(AS)的Bel- 74 0 2细胞 ,与对照组Bel- 74 0 2细胞和带PCR3.1空载体的Bel-74 0 2细胞比 ,增殖速度下降 ,FCM的结果也证明实验组细胞大部分受阻于G0 /G1期 ,与细胞对照组及载体对照组有显著的差异。结论 :P5 3反义RNA可有效地抑制肝细胞癌中突变型P5 3的致癌性 ,可用于肝细胞癌实验性基因治疗研究。

p53反义RNA对人肺癌细胞表型和顺铂敏感性的影响

目的：研究外源P53反义RNA对有P53基因248密码点突变的人肺癌细胞系恶性表型和顺铂敏感性的影响。方法：构建反义P53cDNA真核细胞表达载体，PEGFP－P53（AS），经酶切图证明反向联结质粒，Lipofectin介质转染有P53基因248密码点突变的人肺癌细胞系801－D，经G418筛选获耐受克隆，稀释法建立单细胞克隆系，PCR检测外源基因，荧光显微镜检测细胞绿荧光蛋白表达，P53单抗免疫组化染色检测P53突变蛋白表达，体外集落形成，检测细胞恶性生长。流氏细胞仪检测细胞周期，MTTI地检测细胞对顺铂药物敏感性。结果：酶切图证明了P53－cDNA反向联结于质粒，构建了PEGFP－P53（AS），建立了转染单细胞克隆系PEGFP－P53（AS）－801D及空载细胞系PEGFP－801D。PCR检测外源P53基因和neo基因存在于转染细胞PEGFP－P53（AS－801D。荧光显微镜下发现胞浆有绿荧光蛋白表达，免疫组化染色P53突变蛋白801D细胞系为阳性，而PEGFP－P53（AS）－801为阴性，证明外源反义P53封闭转染细胞内源突变蛋白表达。与母系相比PEGFP－P53（AS）－801D集落形成抑制率为61％（P＜0．01），流氏细胞仪检测PEGFP－P53（AS）－801D细胞G1期细胞数明显增加，出现G1期阻止的表现，MTT检测PEGFP－P53（AS）－801D对顺铂比母系更为敏感。结论：有P53基因248密码点突变的801D细胞恶性增殖明显，对顺铂耐药，外源P53反义RNA可封闭突变蛋白表达，抑制801D细胞体外恶性增殖，增加对顺铂的药物敏感性，证明P53突变的恶笥表型可以被抑制或野生型P53功能可得到恢复。

长链非编码RNA EMX2OS调控miR-150/TP53轴对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的探讨EMX2反义RNA(EMX2OS)靶向微小RNA-150(miR-150)/肿瘤蛋白p53(TP53)轴在宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭过程中的作用。方法采用实时定量PCR(qPCR)检测EMX2OS和miR-150在宫颈癌细胞中的表达。利用EMX2OS过表达载体pcDNA3.1-EMX2OS或miR-150模拟物(mimics)转染C-33A细胞后分为4组:pcDNA3.1组、pcDNA3.1-EMX2OS组(过表达EMX2OS)、pcDNA3.1-EMX2OS+miR-NC组和pcDNA3.1-EMX2OS+miR-150 mimics组(过表达EMX2OS和miR-150)。通过MTT法、划痕实验和Transwell实验检测细胞的增殖、迁移和侵袭情况。双荧光素酶报告基因实验验证EMX2OS/miR-150和miR-150/TP53的靶向作用关系。结果EMX2OS在宫颈癌细胞中表达下调,而miR-150表达上调(P<0.05)。与pcDNA3.1组相比,pcDNA3.1-EMX2OS组C-33A细胞的增殖活力、划痕愈合率、穿膜细胞数量和miR-150表达水平降低,而TP53表达水平升高(P<0.05)。与pcDNA3.1-EMX2OS+miR-NC组相比,pcDNA3.1-EMX2OS+miR-150 mimics组C-33A细胞的增殖活力、划痕愈合率、穿膜细胞数量和miR-150表达水平升高,而TP53表达水平降低(P<0.05)。EMX2OS和TP53均能够与miR-150靶向结合。结论EMX2OS可能通过miR-150/TP53轴来抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭,有望成为宫颈癌治疗的潜在靶点。

WD40编码的P53 RNA反义转录子基因和蛋白及其功能

WD40编码的P53 RNA反义转录子(WRAP53)基因有1α、1β和1γ三个起始外显子,1α与P53的第一外显子反向互补,其表达产物能稳定P53 RNA水平,从而促进P53蛋白表达,最终参与调控肿瘤的生物学行为;1β转录翻译生成的WRAP53蛋白,涉及细胞程序性死亡、周期调控以及蛋白酶降解和RNA代谢等多个重要生化过程。WRAP53蛋白主要通过与端粒酶复合体等多种组分结合参与端粒酶卡侯体(CB)的形成、端粒酶全酶的组装定位、端粒酶的运输,指导运动神经元生存蛋白定位至CB等。WRAP53基因在肿瘤细胞系和临床肿瘤样本中普遍高表达,且表达越高,肿瘤的预后越差。沉默WRAP53基因,可明显抑制肿瘤细胞的生长和成瘤能力。先天性角化不良综合征与端粒长度的缩短有关,WRAP53基因表达降低最终会导致端粒的缩短。

反义P^(53)基因和mdm_2基因对肺腺癌细胞恶性表型双重抑制作用的实验研究

目的研究反义P53基因和mdm2基因对肺腺癌细胞中突变型P53的双重抑制，并观察其抑制肺腺癌细胞生长和促进恶性表型逆转作用。方法利用能表达反义产P53和mdm2基因的逆转录病毒表达载体在脂质体介导下，将PDOR－mdm2基因转染含有PDOR－FP53的肺腺癌GLG-82细胞中。经G418筛选获得GLG-82细胞同时含有反义P53基因和mdm2基因的克隆，这种双重转染的GLC－82细胞命名为PDOR－FP53／mdm2，并与导入空载体PDOR－neo和GLC-82亲本细胞作比较。通过DNA、RNA杂交观察外源基因转染细胞中表达情况，细胞生长曲线测定和3H－TdR掺入、软琼脂培养集落形成试验、流式细胞仪测定观察其对肺腺癌GLC-82细胞恶性表型的抑制作用。结果DNA、RNA杂交证实反义P53和mdm2基因转染GLC－82细胞成功并获得表达。细胞生长曲线测定和3H-TdR掺入试验结果表明，转染PDOR-PP53／mdm2基因的GLC-82细胞较转染PDOR-neo的GLC-82细胞活力减弱、增殖能力下降、DNA合成受阻、软琼脂培养集落形成率低。细胞周期分析结果显示，转染PDOR－FP53／mdm2的细胞G1期峰增高和S期峰降低，提示DNA合成减慢，细胞增殖受到抑制。结论反义P53基因和mdm2基因对肺腺癌细胞恶性表型有双重抑制作用。

反义hTERT对人肺巨细胞癌细胞系p53表达的影响

目的:本研究以端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetrascriptase,hTERT)基因的全长序列构建反义hTERT的真核表达载体,以此来转染肿瘤细胞PLA 801D,观察反义hTERT对其细胞周期分布及对p53表达的影响。方法:构建了包含hTERT全长基因序列的反义hTERT基因真核表达载体pcDNA3. 1(-) -hTERT,并稳定转染人肺巨细胞癌细胞系PLA 801D,观察基因转染前后,流式细胞术检测PLA 801D细胞的周期分布,用半定量RT- PCR检测p53mRNA的表达水平,免疫组化检测突变型p53蛋白阳性表达率的差异。结果:全长的反义hTERT基因可显著地抑制p53mRNA的表达,使细胞周期的分布出现G0 /G1期阻滞,突变型p53蛋白阳性率显著下降。结论:反义的hTERT基因可有效的抑制p53mRNA及突变型蛋白的表达水平,引起细胞周期阻滞,使细胞的恶性增殖减缓。

LSAMP-AS1/LSAMP通过PI3K/Akt/MDM2/p53信号通路调控胃癌作用研究

目的 探索长链非编码RNA边缘系统相关膜蛋白反义RNA(LSAMP-AS1)和边缘系统相关膜蛋白(LSAMP)基因在胃癌组织中的表达及临床意义。方法 收集川北医学院附属医院胃肠外科2016-01-04-2018-06-20手术治疗的60例胃癌患者癌组织和癌旁组织标本。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测胃癌组织LSAMP-AS1、LSAMP、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、鼠双微基因2(MDM2)和p53的表达水平并分析其关系,采用蛋白质印迹法检测LSAMP的表达。胃癌组织和癌旁组织之间LSAMP、LSAMP-AS1表达量符合正态分布,选用配对t检验;不符合正态分布的信号通路分子的表达比较选择Wilcoxon符号秩检验。结果 (1)在胃癌和癌旁组织中,LSAMP-AS1的表达量分别为1.18±1.39和2.21±2.60,差异有统计学意义,配对t=3.169,P=0.002;LSAMP的表达量分别为1.90±2.78和2.76±3.55,差异有统计学意义,配对t=2.591,P=0.012。(2)LSAMP-AS1表达与LSAMP呈正相关,r=0.740,P<0.001。(3)LSAMP-AS1低表达癌组织中,PI3K表达高于癌旁组织(Z=-1.586,P=0.063),MDM2低于癌旁组织(Z=-2.749,P=0.007),p53低于癌旁组织,Z=-2.372,P=0.018。(4)LSAMP低表达癌组织中,PI3K表达高于癌旁组织(Z=-4.240,P<0.001)、MDM2低于癌旁组织(Z=-2.749,P=0.006),p53低于癌旁组织,Z=-2.482,P=0.013。结论 (1)LSAMP-AS1和LSAMP可能作为抑癌基因参与胃癌的发生发展;(2)低表达LSAMP-AS1和LSAMP可作为不良预后指标,为胃癌诊断、预后判断提供重要参考依据;(3)LSAMP-AS1和LSAMP可能通过PI3K/Akt/MDM2/p53信号通路调控胃癌的发生发展。

p53反义RNA对肠癌细胞恶性表型的抑制作用

研究ｐ５３反义ＲＮＡ对大肠癌细胞中突变型ｐ５３致癌性的抑制效应，为肿瘤基因治疗提供新思路。方法２．１ｋｂ的人ｐ５３全长ｃＤＮＡ反向插入哺乳动物表达载体ｐＲＥＰ９，得到ｐ５３反义ＲＮＡ表达载体ｐＲＥＰ９－ｐ５３（ＡＳ），并将其导入人肠癌细胞株ＳＷ１１１６（内源性突变型ｐ５３），采用ＭＴＴ和ＦＣＭ方法测定ｐＲＥＰ９－ｐ５３（ＡＳ）表达的ｐ５３反义ＲＮＡ对ＳＷ１１１６细胞生长的影响。结果带有ｐＲＥＰ９－ｐ５３（ＡＳ）的ＳＷ１１１６细胞，与对照组ＳＷ１１１６细胞和带ｐＲＥＰ９空载体的ＳＷ１１１６细胞相比，由于ｐ５３反义ＲＮＡ的表达，其增殖速度显著下降，ＦＣＭ的结果也证明带ｐＲＥＰ９－ｐ５３（ＡＳ）的细胞部分受阻于Ｇ０／１期，而带ｐＲＥＰ９空载体的细胞则无明显变化。结论ｐ５３反义ＲＮＡ可以有效地抑制大肠癌细胞中突变型ｐ５３的致癌性。

EGFR反义RNA与p53基因联合转导抑制胶质瘤细胞增殖的体外实验研究

肿瘤的发生、发展是一个多基因参与、多步骤演变的复杂过程。单一的基因治疗的效果并不理想。为此有必要将相互间有叠加或协同效应的基因治疗联合应用。我们发现在恶性胶质瘤中血管内皮生长因子受体（EGFR）过表达及p53基因突变往往并存，为此将反义EGFR—RNA及p53同时转染恶性胶质瘤细胞系，研究两者联合基因转导对胶质瘤细胞增殖与凋亡的影响，为应用联合基因治疗提供实验依据。

个体性反义RNA对乳腺癌细胞突变p53基因表达的特异性封闭作用

目的研究针对 p53基因突变的个体性反义 RNA 对乳腺癌突变 p53基因的特异性封闭作用。方法通过免疫细胞化学 LSAB 法染色、聚合酶链反应-单链构象多态性分析及测序确定人乳腺癌细胞系 MDA-MB-231中 p53突变位点,构建针对该突变点的反义表达载体并制备其反义RNA。原位杂交技术检测反义 RNA 与细胞内突变 p53基因的特异性结合;在阳离子脂质体介导下将反义 RNA 转染细胞;以免疫细胞化学 LSAB 法染色及细胞生长抑制率观测反义 RNA 作用时效;Western blot 检测 p53蛋白的表达;四甲基偶氮唑盐法检测转染细胞的生长活性;流式细胞术检测转染细胞的细胞周期分布;原位缺口末端标记法检测转染细胞的凋亡情况。结果人乳腺癌细胞系MDA-MB-231的 p53第8外显子(exon8)有突变,据此位点构建反义表达载体[pGEM3zf(+/-)p53exon8]。原位杂交结果显示反义 RNA(ASp53exon8′RNA)在细胞质内有阳性杂交信号;于转染后48 h 反义 RNA 封闭效果最显著,突变 p53蛋白(mt-p53)的表达受抑制,细胞增殖能力下降,G_2/M 期阻滞。结论针对 p53基因突变位点制备的个体性反义 RNA 可特异性封闭乳腺癌细胞突变 p53基因的表达。

反义热休克蛋白hsc70对突变型p53蛋白稳定性的影响

目的 探讨反义hsc70RNA对突变型p5 3稳定性的影响。方法 利用DNA重组技术构建反义hsc70真核表达质粒pXAhsc70。脂质体介导将重组质粒转染至MCF 7/Adr人乳腺癌细胞 (突变型p5 3) ,经PCR确定转染细胞中外源DNA存在后 ,以Westernblot检测hsc70蛋白的抑制程度。p5 3稳定性实验分析反义hsc70RNA对突变型p5 3半衰期的改变。结果 建立稳定表达反义hsc70RNA的细胞株MAc70 ,hsc70蛋白表达下降 42 % ,其胞内突变型p5 3含量下降 ,半衰期缩短 ,稳定性下降。结论 反义hsc70RNA能够明显地降低突变型p5 3稳定性。

长链非编码RNA母源性印记基因3对人胰腺癌SW1990细胞生物学行为及p53蛋白水平的影响

我们选取母源性印记基因3（MEG3）表达缺失的人胰腺癌SW1990细胞株,向其导入并表达外源性MEG3基因片段,观察胰腺癌细胞的增殖、凋亡和p53蛋白水平的变化.

突变p53基因的反义拯救研究

目的研究p53基因的个体性反义RNA联合野生型p53(wt-p53)对乳腺癌细胞的增殖抑制作用,探讨体外双重基因治疗的意义。方法将wt-p53重组质粒pC53-SN3转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞,G418筛选稳定表达wt-p53的细胞克隆(WTp53-231细胞);体外构建针对MDA-MB-231细胞p53基因突变外显子8(exon8)的反义表达载体[pGEM3zf(+/-)p53exon8],并制备其反义RNA(ASp53exon8’RNA);以MDA-MB-231细胞为对照,阳离子脂质体介导下ASp53exon8’RNA转染WTp53-231细胞;转染48h后,用MTT法检测细胞生长活性,TUNEL法检测细胞凋亡情况,免疫细胞化学LSAB染色法检测p53蛋白的表达。结果ASp53exon8’RNA转染WTp53-231细胞与ASp53exon8’RNA转染MDA-MB-231细胞比较,前者可进一步抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡。结论p53基因的个体性反义RNA联合wt-p53共转染可协同抑制乳腺癌细胞增殖,达到"反义拯救"基因治疗目的。

热休克蛋白70对X射线照射下wtp53蛋白的影响

目的 探讨反义热休克蛋白 70 (hsc70 )在X射线照射下对野生型p5 3(wtp5 3)的影响。方法 利用脂质体方法将本室构建的反义hsc70真核表达重组质粒pXAhsc70转染wtp5 3的MCF 7乳腺癌细胞 ,PCR证实外源DNA存在。Westernblot检测hsc70蛋白下降程度。X射线照射转染细胞后 ,检测wtp5 3蛋白的表达情况及半衰期变化。结果 转染重组质粒的细胞中hsc70蛋白下降 5 3% ;不同剂量X射线照射下 ,反义hsc70的存在能够提高wtp5 3的表达 ;4Gy相同剂量照射后 ,转染反义hsc70重组质粒的细胞中wtp5 3的半衰期延长。结论 反义hsc70能够上调wtp5 3的表达、稳定X射线照射下的wtp5 3蛋白并延长其半衰期 ;推测hsc70可能参与了wtp5