延边黄牛和韩延牛血液外胞体中miRNA的差异表达分析

为进一步探讨Exosome中miRNA对延边黄牛和韩延牛生长发育的分子调控差异。本研究从延边黄牛和韩延牛血液Exosome中分离出miRNA,通过RNASEQ测序和生物信息学技术分析了延边黄牛及韩延牛血液Exosome中miRNA的表达特点。结果表明,在延边黄牛和韩延牛血液Exosome中获得差异表达miRNA有524个,其中上调表达的271个,下调表达的253个,其中已知miRNA382个,新miRNA142个;差异表达miRNA的靶基因预测结果说明,在两个品种牛中共预测到52348个靶基因。GO富集分析可知,这些靶基因被富集到3473条生物学过程,394条细胞组分以及879条分子功能。KEGG分析可知,这些预测得到的miRNA的靶基因总共被注释到326条信号通路中,其中最显著富集的通路为mTOR信号传导通路。其中显著差异表达的miR-9-5p和miR-99b调控的一些靶基因都与mTOR信号通路有密切的关系。结论:血液Exosome中的miR-9-5p和miR-99b在延边黄牛和韩延牛生长发育差异的过程中可能发挥重要的作用。将为下一步在分子水平上探讨关键差异表miRNA影响边黄牛和韩延牛生长发育差异的分子机制提供试验基础。

胞外体在肿瘤发展中的作用及其在肿瘤诊疗中应用的研究进展

胞外体来源于机体细胞,具有纳米级囊泡结构,在恶性肿瘤发生和发展中发挥重要作用。囊泡可运载不同成分,成为肿瘤药物治疗的有效传递工具。胞外体具有天然的生物学起源,不易被免疫系统排斥,可参与基因转录、基因翻译调节、生长、增殖、再生及发育等生理功能,在恶性肿瘤诊疗中发挥重要作用。肿瘤来源胞外体可以通过多途径促进肿瘤侵袭、迁移和血管生成,诱导化学治疗耐药及肿瘤免疫逃逸,从而促进癌症发生和发展。胞外体可通过进行新型肿瘤标志物的探索、肿瘤疫苗的开发研究、作为药物传递的载体等方面发挥对肿瘤诊疗的作用,有望成为肿瘤药物治疗的有效靶向运载工具。

脂肪干细胞来源胞外体在创面修复中的机制研究进展

本文主要就脂肪干细胞来源胞外体在创面修复中的机制及其临床潜力进行综述,以期为脂肪干细胞来源胞外体促进创面愈合提供研究方向与理论依据。

胞外体——免疫治疗中的“特洛伊木马”

胞外体是源于多种真核细胞的多泡体,通过后者与质膜融合释放到细胞外的一种膜性小囊泡,在多种生理过程中发挥作用。近年研究发现,由抗原提呈细胞分泌的胞外体富集MHCI/II类分子、协同刺激分子、热休克蛋白70和热休克蛋白90等多种生物活性分子于一身,像“特洛伊木马”一样,在体内外免疫调节中起关键作用。本文就胞外体的基本特征、生产纯化方法及其作为一种新型的亚细胞疫苗在抗肿瘤和抗病毒免疫中的应用前景予以综述。

树突状细胞胞外体(Exosome)的超滤离心法提取及形态观察

目的:利用树突状细胞(DC)胞外体(Ex)的物理特性,探讨基于DC-Ex的大小和密度,用超滤离心法制备DC-Ex的实验方法,以改进传统方法、提高收获效率。方法:选用小鼠树突状细胞株DC2.4为研究对象,收集细胞培养上清,中空纤维器去除细胞及细胞碎片,Amicon Ultra超滤离心管压缩体积,密度梯度超离心纯化获得DC-Ex提取物。对照组则采用传统的分级分离方法。应用透射电镜进行形态学鉴定,并采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot进行检测。结果:DC-Ex提取物超微结构形态及SDS-PAGE带型和文献报道类似,包含有主要的特征性标志物分子MHC-I,MHC-II,CD80和CD86;与分级分离法相比,超滤离心法耗时少,产量和纯度较高。结论:超滤离心法是一种简便高效的提取Ex的方法。

白血病细胞来源胞外体的生物学特性及其致敏DC的抗白血病效应

目的:探索白血病细胞来源的胞外体(leukemia cell-derived exosome,LEX)的生物学特性及其致敏DC的抗白血病免疫效应。方法:超速离心分离纯化BCR-ABL阳性的白血病K562细胞来源的胞外体(LEXK562),采用免疫电镜及Westernblotting检测LEXK562中热激蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)及BCR-ABL的表达,采用激光扫描共聚焦显微镜及流式细胞术检测LEXK562靶向结合DC的动力学,采用LDH释放法以及小鼠模型体内实验检测LEX及其致敏DC的抗白血病免疫效应。结果:与其他细胞来源的胞外体相似,K562细胞来源的胞外体LEXK562为直径50～100 nm的囊状结构,且表达K562细胞特异性的BCR-ABL和HSP70分子。LEXK562在体外可靶向结合DC,3～4 h到达高峰,并能在DC中稳定存在72 h以上。LEXK562致敏DC(DC/LEXK562)诱导的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)可有效杀伤K562靶细胞,效靶比为50∶1时,其杀伤活性显著高于LEXK562诱导的CTL[(68.6±5.7)%vs(22.5±2.9)%,P<0.01];体内实验进一步证实,白血病L1210细胞来源的胞外体(LEXL1210)免疫后小鼠接种L1210细胞的成瘤率明显高于LEXL1210致敏DC(DC/LEXL1210)免疫小鼠的成瘤率[(54.17±8.33)%vs(16.67±4.18)%,P<0.05]。结论:LEX表达白血病细胞相关抗原,LEX体外可靶向结合DC,其致敏的DC能诱导更强的抗白血病免疫效应。

肿瘤细胞来源的胞外体诱导机体免疫耐受及其临床应用

胞外体（Exosomes,EXO）是真核细胞释放的纳米级膜性小囊泡,是由细胞的多泡体（Multivesicular bodies,MVBs）出胞时与细胞膜融合后,向细胞外释放的囊性结构.多种类型真核细胞可以释放EXO.EXO生物学功能与其所来源的细胞直接相关,其诱导的免疫激活作用早已备受关注,并应用至肿瘤免疫的实验研究.然而,越来越多的研究表明,EXO在特定环境中亦同样可诱导免疫耐受,这无疑给肿瘤的免疫治疗带来了新的挑战.EXO诱导的免疫耐受可通过下调机体免疫监视,促进肿瘤生长及转移.这一新发现逐渐平息了研究者对EXO作为抗肿瘤新方法的狂热,但却为治疗自身免疫性疾病、同种异体移植等疾病带来了新希望.EXO诱导的免疫耐受应用于相关疾病的治疗将成为研究热点.

PHGPx在体外共培养山羊睾丸生精细胞中的定位研究

为探讨磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)在雄性动物生殖机能中的作用及其在体外培养山羊睾丸生精细胞的定位,在已成功构建的山羊睾丸支持细胞-生精细胞共培养的基础上,制作细胞爬片,采用免疫细胞化学技术定位PHGPx的表达。结果显示,PHGPx在支持细胞、精原细胞中不表达,在圆形精子细胞细胞质检测到阳性表达产物。表明PHGPx在精子发生后期圆形精子的变态发育中起特定的调节作用,但作用机制有待深入研究。

胞外体认识之新进展

胞外体是由多种细胞分泌的一种膜性小囊泡，参与多种生理及病理生理过程。近年研究发现，由抗原提呈细胞分泌的胞外体富集MHCⅠ/Ⅱ类分子、协同刺激分子、热休克蛋白70～90等多种生物活性分子于一身，在体内外免疫调节中起关键作用。就胞外体的基本特征及其作为一种新型的亚细胞疫苗在抗肿瘤和抗病毒免疫中的应用前景予以综述。

CREM在体外共培养山羊睾丸生精细胞中的定位研究

为进一步深入研究CREM基因在雄性动物中的表达调控机制,试验成功建立体外生精细胞和支持细胞共培养体系,并应用免疫细胞化学研究CREM在体外培养山羊睾丸生精细胞的表达特点。结果显示:CREM仅表达于圆形精子细胞,其他生精细胞和支持细胞检测不到CREM的表达。表明CREM基因在圆形精子细胞发育过程中起重要调节作用,但其作用机制有待深入研究。

人体体液中细胞外microRNA的起源、功能及潜在诊疗价值

最近大量的研究表明micro RNAs(miRNAs)是一类重要的调控因子.曾经被认为是非常不稳定的RNA分子——miRNA,却可以稳定存在于血液和其他体液中.更加重要的是,细胞外miRNAs被发现和多种疾病密切相关,它们可以作为诸如肿瘤等各种疾病的非侵入性生物标志物.然而,目前关于细胞外miRNA的来源以及生物学功能还不甚清楚.本文将总结最近细胞外miRNA的研究进展,并将重点介绍细胞外miRNA在疾病诊断及治疗中的作用.

骨关节炎患者成骨细胞胞外体miRNAs表达谱的差异

目的:通过分析骨关节炎(osteoarthritis,OA)患者软骨下骨组织中成骨细胞胞外体miRNAs的表达差异,探究OA发生发展过程中可能涉及的关键胞外体miRNAs。方法:共纳入6名膝OA患者,收集其膝关节软骨下骨组织,选取磨损严重侧为OA组,取磨损较少侧为正常对照组。细胞培养后提取成骨细胞胞外体,进行特征鉴定。提取胞外体miRNAs,用高通量测序并筛选两组间表达差异显著者(log2Ratio≥2)进行靶基因预测分析,并进一步行定量反转录PCR分析。结果:提取物经鉴定为胞外体,在扫描电镜下呈囊泡状双层膜结构,直径30～200 nm,体积峰度50～150 nm。高通量测序共筛出5个OA组表达显著上调的miRNAs,差异倍数最大者为hsa-miR-4717-5p,预测靶基因为RGS2;定量反转录PCR亦显示OA组hsa-miR-4717-5p相对表达量较对照组显著增高(2.243 vs 0.480,P<0.01)。结论:OA患者成骨细胞胞外体miRNAs表达谱较正常者有显著差异。部分表达显著上调的miRNAs可能通过代谢相关通路介导OA的发生和发展。

口腔鳞癌细胞分泌的胞外体对其生物学行为的影响

目的:研究口腔鳞状细胞癌细胞细胞株(OSC-4)分泌的胞外体对细胞生物学行为的影响。方法:培养OSC-4,从其上清培养液中分离提纯胞外体(exosome,EXO),CD9标记,将提取的胞外体作用于OSC-4,MTT检测胞外体对OSC-4增殖能力的影响,细胞划痕实验检测胞外体对OSC-4迁移能力的影响,transwill小室侵袭实验检测胞外体对OSC-4侵袭能力的影响。结果:细胞上清液提取物免疫金标结果可见金标记的CD9,即分离提纯物为胞外体;MTT检测结果显示胞外体作用后的OSC-4的增殖能力增强(P<0.05),细胞划痕实验结果显示其迁移能力增强和transwill小室侵袭实验结果显示其侵袭能力也增强(P<0.05)。结论:OSC-4分泌的胞外体可以促进口腔鳞状细胞癌细胞的增殖、迁移、浸润能力。

淋巴瘤细胞胞外体生物学特性及其抗淋巴瘤效应的研究

目的:研究淋巴瘤细胞胞外体(lymphoma cell-derived exosomes,LCEX)的生物学特性及其在抗肿瘤免疫中的作用,探讨以胞外体为基础的肿瘤免疫治疗的可行性。方法:本研究以Raji细胞株为淋巴瘤细胞模型,应用免疫电镜,Westernblot,共聚焦显微镜以及细胞毒杀伤实验等技术对其释放的LCEX的生物特性进行初步研究。结果:淋巴瘤细胞同样也能释放胞外体,与其他肿瘤细胞相似,LCEX同样负载重要的免疫分子HSP70及ICAM-1分子。同时,LCEX能够在体外靶向结合树突状细胞(dendriticcell,DC),并能诱导抗原特异性的抗淋巴瘤效应。结论:淋巴瘤细胞同样能够释放胞外体,LCEX负载有淋巴瘤细胞的相关蛋白分子,有望成为淋巴瘤细胞抗原的重要来源之一,体外致敏DC能够诱导抗淋巴瘤免疫,在淋巴瘤免疫治疗方面具有广阔的应用前景。

缺氧对合体滋养细胞胞外体分泌和Rab11蛋白表达的影响

目的探讨缺氧条件下,Rab11蛋白的表达变化及其在合体滋养细胞胞外体(syncytiotrophoblast exosome,STBEX)过度分泌中的作用。方法将传代培养的Be Wo细胞分为4组(n=24),1Be Wo常氧组:Be Wo细胞在普通培养基、常氧条件下培养;2Be Wo低氧组:Be Wo细胞在普通培养基、低氧条件下培养(92%N2、5%CO2、3%O2);3融合Be Wo常氧组:Be Wo细胞以佛司可林(Forskolin)合体化刺激48 h后,常氧条件下培养;4融合Be Wo低氧组:Be Wo细胞以Forskolin合体化刺激48 h后,低氧条件下培养(92%N2、5%CO2、3%O2)。收集各组细胞上清液并检测STBEX蛋白浓度,采用Western blot检测各组细胞HIF-1α、Rab11蛋白的表达。结果与融合Be Wo常氧组比较,融合Be Wo低氧组上清液中STBEX的蛋白浓度升高,差异具有统计学意义(P<0.05);与Be Wo常氧组比较,Be Wo低氧组上清液中STBEX蛋白浓度升高,差异具有统计学意义(P<0.05);Western blot检测结果:与常氧培养组相比,低氧培养组细胞中HIF-1α与Rab11蛋白表达升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论缺氧条件下Rab11蛋白可能促进合体滋养细胞胞外体的过度分泌。

胞外体在微RNA转运过程中的作用

胞外体来源于多种真核细胞的多泡体（MVBs）内部的小囊泡，在电镜下呈典型的杯状，由脂质双层膜包绕的扁平半球体，直径约40～100 nm。MVBs 可能通过内出芽的方式形成小囊泡，而一些蛋白、脂质和核酸就分选进入这些小囊泡中，被释放到细胞间隙成为胞外体［1］。胞外体的实质是细胞内产生的小囊泡，在形成过程中“不可避免”携带参与细胞生命过程的各种蛋白、脂质以及核酸。微 RNA（MicroRNA）是由21～25个核苷酸构成的非编码小分子 RNA，曾经被视为无功能的分子［2］。近年来已经成为分子生物学领域的研究热点，参与了细胞内多种基因的表达调控［3］。已经证实 microRNA 存在于胞外体中，胞外体如同“特洛伊木马”参与 microRNA 在细胞间的转运而影响靶细胞功能。

间充质干细胞来源的胞外体对阿尔茨海默病的调控作用

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)为最常见的老年痴呆性疾病之一,约占所有痴呆患者的75%。其病理特征为具有很强神经毒性作用的β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)沉积在脑组织,并且许多神经元内tau蛋白的过度磷酸化形成神经纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFT),导致大量神经元坏死,大脑功能调控紊乱,从而出现严重的认知功能障碍。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一种成体干细胞,能产生大量多囊泡体分泌至胞外形成胞外体。胞外体大小不等,直径为30~150 nm,可跨越血脑屏障,携带大量小分子miRNA和蛋白质分子到达脑组织内发挥作用。MSCs来源的胞外体对AD具有调控作用。

鸭坦布苏病毒感染对BHK-21细胞分泌胞外体的影响

目的:探讨鸭坦布苏病毒感染BHK-21细胞对胞外体的影响,进一步研究鸭坦布苏病毒的致病机制。方法:利用鸭坦布苏病毒AH-F10株感染BHK-21细胞,并设置未感染病毒的对照组。用PEG法提取感染病毒的BHK-21细胞和对照组细胞上清中的胞外体,通过电镜观察、Western blot检测对胞外体进行鉴定,并对提取的两组胞外体进行质谱鉴定分析。结果:电镜观察到纯度高的内部色浅、边缘浓染的杯状囊泡,直径30~160 nm。感染组胞外体的平均粒径大小大于对照组胞外体的平均粒径大小。Western blot试验中,均检测出CD9、CD63分子。应用液相质谱法从胞外体中鉴定出106种蛋白,其中感染坦布苏病毒组共检测出84种蛋白,对照组49种蛋白,有27种共同蛋白分子。结论:鸭坦布苏病毒感染BHK-21细胞会影响细胞胞外体的分泌,影响胞外体粒径大小及其蛋白组成成分。本试验为进一步研究坦布苏病毒的感染和致病机制奠定了基础。

胞外体来源的非编码RNA在颅脑创伤中的作用

颅脑创伤是世界范围内死亡和致残的主要原因,给公共健康带来了巨大的威胁,但目前的诊断和治疗手段十分有限。胞外体是介导细胞间通信和物质转运的微囊泡,其中包含了丰富的非编码RNA。它们参与颅脑创伤后的病理生理反应过程,但具体的作用机制仍不明确。作为胞外体内容物的重要组成部分,非编码RNA对研究颅脑创伤的诊断、精准治疗、疗效评估、预后预测及并发症的防治等均具有重要意义。

胞外体在脓毒症中脏器功能保护机制的研究进展

脓毒症的病理生理机制复杂,为严重感染引起的机体反应失调和免疫紊乱而导致的多器官功能障碍,严重时可引发脓毒性休克。尽管对脓毒症采取积极的治疗,其病死率仍高居不下。胞外体为细胞分泌的囊泡,可通过携带信使RNA、微RNA和蛋白质等物质进行细胞间信号交流,改变受体细胞的表型与功能。胞外体可调节脓毒症的炎症反应并修复其受损的器官功能,在脓毒症脏器功能保护方面发挥着重要作用。因此,探究胞外体与脓毒症之间的关系,可能对脓毒症的早期预防与治疗有重要意义。