耐亚胺培南铜绿假单胞菌外膜孔蛋白与β-内酰胺酶研究

目的探讨铜绿假单胞菌外科监护室分离株对碳青酶烯类抗菌药物耐药机制。方法琼脂稀释法测定抗菌药物最低抑菌浓度(MIC);提取β-内酰胺酶进行三维水解试验及等电聚焦电泳;紫外分光光度计测定酶活性;用PCR扩增IMP、VIM金属酶基因;用Western印迹分析外膜孔蛋白OprD2表达水平。结果从外科监护室分离的49株铜绿假单胞菌,有41株对亚胺培南耐药;耐药组34株菌产AmpC酶,其中8株同时产ESBLs酶,2株仅产ESBLs,未筛选出产金属酶菌株;亚胺培南耐药组酶活性(74.32±53.42)μmmol/mg与亚胺培南敏感组酶活性(8.7±16.16)μmmol/mg比较差异有统计学意义(P<0.01);耐药组OprD2表达均有不同程度的降低或缺失,而敏感组均正常表达OprD2,耐药组OprD2相对表达量(0.20±0.27)与敏感组(3.10±2.20)比较差异有统计学意义(P<0.01);未扩增出IMP、VIM金属酶基因。结论外膜孔蛋白OprD2表达降低或缺失以及高活性AmpC酶,是外科监护室耐亚胺培南铜绿假单胞菌的主要原因,与IMP、VIM金属酶关系不大。

重庆某三甲医院2014-2016年铜绿假单胞菌耐药表型及金属酶、外膜孔蛋白耐药基因型分析

目的检测亚胺培南耐药铜绿假单胞菌金属酶基因分布和外膜孔蛋白OprD2基因缺失情况,了解铜绿假单胞菌的耐药状况。方法收集第三军医大学大坪医院野战外科研究所2014-2016年临床分离的非重复铜绿假单胞菌1 887株,VITEK-MS质谱仪进行菌株鉴定,最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)法测定其对10种常用抗菌药物的敏感性,利用WHONET5.6软件对药敏资料进行统计分析,同时采用亚胺培南-EDTA纸片法筛选金属酶表型阳性的菌株,用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)测铜绿假单胞菌金属β-内酰酶(metallo-β-lactamase,MBL)相关基因(IMP、VIM、SPM、GIM、SIM、NDM)和外膜孔蛋白OprD2基因的情况。结果 3年中铜绿假单胞菌每年的分离数量分别为756株(9.4%)、579株(9.5%)和552株(10.7%),主要来自ICU病房和呼吸内科病房,标本类型以痰液为主;2014-2016年分离出的铜绿假单胞菌对妥布霉素、庆大霉素的耐药率逐年下降,其耐药率分别从2014年的11.3%、13.2%下降至2016年的7.8%、9.0%,对左旋氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦的耐药率呈上升趋势,其耐药率从2014年的10.7%、9.2%上升至2016年的23.5%、11.6%。从基因型分布情况来看,269株亚胺培南耐药铜绿假单胞菌中MBL基因阳性51株(18.9%),外膜孔蛋白OprD2缺失158株(58.7%);51株产酶菌株中VIM型阳性29株,SPM型阳性22株,未检测出其他基因型。结论铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药率较高;产MBL和外膜孔蛋白OprD2基因缺失是引起铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的主要原因。

碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌外排泵和外膜孔蛋白表达水平的研究

目的探讨我国临床分离的碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌外排泵MexAB-OprM和外膜孔蛋白OprD2表达水平及其与碳青霉烯类抗生素耐药性之间的关系。方法收集我国15个省市28所医院临床分离的铜绿假单胞菌655株,琼脂稀释法测定该菌加入外排泵抑制剂羟基氰氯苯腙(CCCP)前后对亚胺培南和美罗培南的MIC;RT-PCR检测外排泵MexAB-OprM和孔蛋白OprD2的表达水平;十二烷基硫酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western-blot)检测外膜孔蛋白OprD2。结果收集到的655株铜绿假单胞菌菌株对亚胺培南和美罗培南敏感率分别为52.5%和59.2%,加入CCCP前后其对亚胺培南和美罗培南的敏感率无明显变化;52.0%(51/98)美罗培南耐药株MexAB-OprM显著高表达(P<0.05),43.7%(59/135)亚胺培南耐药株OprD2显著低表达(P<0.05),14.8%(20/135)亚胺培南耐药株OprD2表达缺失;SDS-PAGE和Western-blot显示与标准菌株PAO1相比,OprD2表达水平减低菌株ZZ20显影减低,表达缺失菌株BJ1不显影。结论MexAB-OprM表达升高和OprD2表达降低甚至缺失是我国铜绿假单胞菌对美罗培南和亚胺培南耐药的重要机制。

铜绿假单胞菌的耐药现状及外膜孔蛋白分析

目的:总结分析我院2007年-2009年铜绿假单胞菌对常用抗生素的耐药状况,以指导临床合理选用抗生素,同时探讨外膜孔蛋白缺失介导的铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药机制。方法:采用PCR方法检测外膜孔蛋白OprD的编码基因,利用Whonet 5.4软件对药敏资料进行统计分析。结果:3年中铜绿假单胞菌每年的分离数量分别为132株、159株和173株,分离率分别为13.6%、14.1%和19.3%,主要分离至呼吸内科和ICU病房,标本类型则以痰液为主,474株铜绿假单胞菌对米诺环素和莫西沙星的耐药率最高,分别是89.50%和81.50%,对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别为37.1%和34.80%,多重耐药菌株占49.50%,其中7.80%为泛耐药菌株。随机选择的8株亚胺培南耐药铜绿假单胞菌中,有一株外膜孔蛋白OprD编码基因出现缺失。结论:铜绿假单胞菌整体耐药现象比较严重,对亚胺培南的耐药率也较高;OprD的缺少是引起本组铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的机制之一。

淋球菌外膜孔蛋白与环丙沙星耐药关系的初探

淋球菌(NG)的细胞壁结构类似于大肠杆菌(E.coli)由外到内分为3层:外膜、胞间质、内膜.外膜上有大量蛋白质,其中第一类蛋白质(P.I)功能上相当于孔蛋白,主要有3种,相对分子质量分别为31000、33000、35000[1-3].环丙沙星(CIP)主要是通过上述3种孔蛋白进入菌体的.当孔蛋白表达下降或不表达时,进入菌体的CIP则减少,细菌对CIP产生耐药性.笔者对5株CIP敏感的NG和3株CIP耐药的NG外膜孔蛋白做了半定量分析,以探讨孔蛋白表达的种类和数量与CIP耐药的关系.

外膜孔蛋白OprD和青霉素结合蛋白在铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药中的作用

铜绿假单胞菌是人体的一种条件致病菌,目前在我国医院获得性感染中占有非常重要的地位,并且随着抗菌药物的广泛应用,其对亚胺培南的耐药率逐年上升,这给临床抗感染治疗带来了很大的困难.目前认为铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药机制主要有如下几个方面：β-内酰胺酶的水解作用、细菌外膜孔蛋白的通透性降低、作用靶位（如青霉素结合蛋白）的改变、主动外排系统高表达、生物膜的产生等[¨].本实验室前期对广州市收集的亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌产金属β-内酰胺酶的情况进行了研究,在此基础上,本研究对这些菌株进行了OprD和青霉素结合蛋白（penicillinbinding proteins,PBPs）这两方面的检测,以全面了解广州地区铜绿假单胞菌分离株对亚胺培南的耐药机制.

一株由插入序列引起外膜孔蛋白OprD2缺失的亚胺培南耐药铜绿假单胞菌

铜绿假单胞菌广泛分布于周围环境及正常人的皮肤、呼吸道和消化道等部位，是年老体弱、慢性疾病和免疫功能低下患者合并感染的常见病原菌之一，有时可引起严重感染，其在各大医院细菌分离率调查中均居于首要位置，由铜绿假单胞菌引起的院内感染高达30％以上。近年来对以亚胺培南为代表的碳青霉烯类抗生素多重耐药铜绿假单胞菌的出现，对临床感染控制构成了严重威胁。

华癸根瘤菌外膜孔蛋白编码基因MCHK_1326突变株的构建与共生固氮表型分析

【目的】Mesorhizobium huakuii 7653R的MCHK_1326基因编码一种外膜孔蛋白,可能参与根瘤菌侵染宿主植物以及结瘤固氮过程,本研究旨在探索该基因在共生固氮中的功能。【方法】生物信息学分析MCHK_1326蛋白的结构特征及生物学功能,启动子原位表达技术检测MCHK_1326共生时空表达特征,利用Cre-loxp系统构建MCHK_1326缺失突变株,考察其共生固氮表型及早期侵染事件,通过植物盆栽并额外添加无机氮源,检测突变株接种紫云英后的共生固氮表型变化。【结果】MCHK_1326基因在侵染早期如侵染线的延伸等过程中表达,在成熟根瘤的侵染区表达,与野生型相比,突变体△1326侵染线和根瘤原基数量显著减少;植株地上部分鲜重与固氮酶活性极显著降低,根瘤数量和根瘤重量显著降低;额外添加无机氮源能恢复其共生缺陷表型。【结论】MCHK_1326基因参与根瘤菌早期侵染和结瘤,在根瘤发育与共生固氮过程中发挥作用。

鮰爱德华氏菌外膜微孔蛋白N基因PCR快速检测方法的建立

根据Gen Bank中鮰爱德华氏菌Edwardsiella ictaluri外膜微孔蛋白N(porin N)基因序列(Gen Bank No:NC_012779.2)设计了1对引物,预计目的片段大小为381 bp。通过对反应体系和条件的优化,并进行特异性试验、敏感性试验及人工感染组织样品检测,建立了一种快速检测鮰爱德华氏菌的PCR方法。结果表明,在所检测的鮰爱德华氏菌、迟缓爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、杀鲑气单胞菌、豚鼠气单胞菌、嗜麦芽寡养单胞菌、鲁氏耶尔森氏菌、海豚链球菌、不动杆菌、产气肠杆菌、大肠杆菌、拟态弧菌、荧光假单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌15种细菌中仅鮰爱德华氏菌扩增出特异性条带;敏感性试验结果显示,该方法最小核酸检出量为9.35×10-3ng·μL-1;同时对人工感染的病料肝脏、细菌基因组DNA、细菌菌液及菌落进行扩增,结果显示4种材料均能检测出大小为381 bp的基因片段。本研究所建立的方法特异强、灵敏度高,适用于鮰爱德华氏菌感染病例的高效、快速检测。

幽门螺杆菌47kDa微孔蛋白基因的克隆表达及特性鉴定

目的对人幽门螺杆菌（H．pylori）编码47kDa外膜微孔蛋白基因omp47克隆表达及特性鉴定，探索研制H．pylori疫苗的新途径。方法培养和收集H．pylori标准菌株NTTCll637及临床菌株，采用酚：氯仿抽提、纯化基因组DNA。设计上下游引物，并以该基因组为模板，采用聚合酶链反应（PCR）扩增omp47基因片断。将目的基因和与克隆载体PGEM-T连接后，转化至EcoliDH5a及BL21，碱裂解提取质粒经BamHl和Xhol双酶切鉴定并进行序列分析。重组蛋白采用IPTG诱导表达后，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）鉴定、镍亲和层析纯化检测抗原活性。结果经酶切、测序分析表明，插入的基因片断为1284bp，编码427个氨基酸。与GenBank公布的H．pylori标准株26695、43504及J99序列比对，核苷酸同源性高达94%～96％，编码氨基酸同源性96%～99%。经SDS-PAGE检测，电泳图谱上显示一条相对分子量为47kda的新生蛋白带。Westernblot检测表明重组蛋白有较好的抗原性。结论成功克隆了外膜微孔蛋白OMP47的编码基因，为H．pylori疫苗的研制和试剂盒的开发奠定了良好的基础。

NCTC11637外膜蛋白36ku基因的克隆及序列分析

目的:对人幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)36ku(OMP36)外膜蛋白进行基因克隆表达,探索研制H.pylori疫苗的新途径。方法:培养H.pylori菌株NCTC11637,采用酚:氯仿抽提和纯化基因组DNA。设计上下游引物,并以该基因组为模板,采用聚合酶链反应(PCR)扩增目的基因片断。将目的基因和PET32a(+)同时经HindⅢ和KpnⅠ双酶切,纯化,连接后,转化含有目的基因的重组载体,酶切鉴定后进行序列分析。结果:经酶切,测序分析表明,插入的基因片断为987bp,与GenBank公布的H.pylori 26695、ATCC43504及J99序列相比较,同源性高达94%-96%,推测的氨基酸序列同源性为97%-99%,GenBank登录号059968。结论:成功克隆了H.pylori 36ku的外膜蛋白的编码基因,其表达产物OMP36有望成为新的Hp疫苗候选分子,为H.pylori疫苗的研制和试剂盒的开发奠定了基础。

耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药机制研究

目的了解我院分离的耐亚胺培南铜绿假单胞菌(PA)耐药机制及同源性分型情况。方法收集临床分离耐亚胺培南PA,用K-B法检测28株耐亚胺培南PA对12种抗菌药的敏感性,用肠杆菌科细菌基因间重复序列(ERIC)进行同源性分析,并用PCR法检测外膜孔蛋白OprD2和金属β内酰胺酶(IMP、VIM)基因。结果28株耐亚胺培南PA对其他12种抗菌药的耐药率在14.8%~42.3%。经ERIC-PCR分析后共有11个基因型。其中A型为11株:A1型9株,A2型2株;B型为5株:B1型2株,B2型2株,B3型1株;C型3株;D型2株;E^K型各1株。PCR检测到OprD2基因仅4株,其缺失率为85.7%,28株PA中检测到1株VIM基因,经测序证实为VIM-2型。结论本院耐亚胺培南PA的主要耐药机制为外膜孔蛋白缺失。在外科和高干病房中出现多种基因型的耐亚胺培南PA传播。

对碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌耐药机制及耐药性的研究

目的了解目前儿科临床分离对碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌外膜孔蛋白OprD2缺失和金属β内酰胺酶(MBL)产生的情况,及具有不同耐药机制菌株的耐药特点。方法收集2004年1月—2006年12月从我院住院患儿中分离出的75株对碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌。用PCR方法进行oprD2基因、金属酶IMP、VIM、SPMT和GIM基因检测。用琼脂稀释法进行药敏试验,按照2006年CLSI推荐标准判断结果。使用WHONET5.3和SPSS13.0软件进行数据分析。结果检测75株对碳青霉烯类抗生素耐药的铜绿假单胞菌中外膜孔蛋白OprD2缺失者50株,占66.7%;产金属酶的46株,占61.3%,其中IMP阳性38株(82.6%),VIM阳性8株(17.4%)。外膜孔蛋白OprD2缺失同时产金属酶的34株,占45.3%,其对β内酰胺类抗生素的耐药率、MIC50和MIC90均高于其他菌株。结论目前从儿科临床分离对碳青霉烯类抗生素耐药铜绿假单胞菌外膜孔蛋白OprD2缺失和产生金属酶都十分严重,菌株的耐药性也很高,并且产MBL菌株存在IMP和VIM2种基因型。

耐碳青霉烯类抗菌药物的耐药性及其相关影响因素

目的对耐碳青霉烯类肠杆菌科产碳青霉烯酶、整合子分布及外膜孔蛋白的缺失情况进行分析和特征讨论。方法收集宜宾市第三人民医院患者的痰液、尿液、分泌物、血液等标本,临床分离的87株对碳青霉烯类抗菌药物耐药的肠杆菌科细菌(CRE)菌株进行分析。结果对87株CRE菌株进行聚合酶链反应扩增碳青霉烯酶基因,检出碳青霉烯酶基因74株,占85.06%。包括肺炎克雷伯菌65株(87.84%),大肠埃希菌6株(8.11%),阴沟肠杆菌、产酸克雷伯菌、产气肠杆菌各1株,分别占1.35%。整合酶基因检测结果显示,Ⅰ类整合子检出52株,检出率为59.77%(52/87),其中47株来自产碳青霉烯酶菌株,5株为非产碳青霉烯酶菌株,同时均以肺炎克雷伯菌检出的比例最高(分别为39株和3株);Ⅱ类整合子检出8株,检出率为9.20%(8/87),其中4株来自产碳青霉烯酶菌株,4株为非产碳青霉烯酶菌株;未检出Ⅲ类整合子。Ⅰ类和Ⅱ类整合子检出3株,2株来自产碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌株,1株为非产碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌株。肺炎克雷伯菌菌株外膜孔蛋白缺失情况表明,70株对碳青霉烯类抗菌药物耐药的肺炎克雷伯菌株中,膜蛋白无异常达18.57%,其中产碳青霉烯酶菌株中膜蛋白无异常为16.92%;OmpK35表达下调的菌株占24.29%,OmpK35缺失的占10.00%;OmpK36表达下调和缺失的比例分别为4.23%和57.14%;产碳青霉烯酶菌株中OmpK35表达下调的菌株占50.77%,OmpK35缺失的占9.23%;OmpK36表达下调和缺失的比例分别为3.08%和55.38%。结论对碳青霉烯类抗菌药物耐药的CRE的耐药情况非常严重,且肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因检出最高,耐药最严重;耐药性的发生还与整合酶基因Ⅰ类整合子,以及孔膜蛋白表达减低与缺失密切相关。

铜绿假单胞菌亚胺培南及消毒剂耐药相关基因研究

目的了解临床分离的对亚胺培南耐药铜绿假单胞菌中金属β内酰胺酶基因(blaIMP和blaVIM)、外膜孔蛋白D2(OprD2)基因(oprD)、消毒剂-磺胺耐药相关基因(qacE△1-sulⅠ)存在状况。方法采用ATBPSE5药敏试验条板微量肉汤法测定28株铜绿假单胞菌对14种抗菌药物的敏感性,采用聚合酶链反应(PCR)技术及序列分析的方法检测耐药基因。结果该28株铜绿假单胞菌对亚胺培南、氨苄西林/舒巴坦、庆大霉素、妥布霉素和复方新诺明均完全耐药,对哌拉西林/他唑巴坦的敏感率最高为64.3%,其余的耐药率在57.1%～92.9%之间。28株Pa中blaIMP和blaVIM基因均阴性,25株(89.3%)oprD基因缺失,24株(85.7%)qacE△1-sulI基因阳性。结论浙江湖州解放军第98医院临床分离的对亚胺培南耐药铜绿假单胞菌多重耐药严重,oprD基因缺失是其对亚胺培南耐药的重要原因,qacE△1-sulⅠ基因携带率很高。

亚胺培南对头孢他啶有诱导作用的铜绿假单胞菌耐药机制研究

目的研究本地区亚胺培南可诱导头孢他啶耐药的铜绿假单胞菌(Pa)发生率及金属酶基因、外膜通道蛋白OprD2基因存在情况及外排泵抑制剂与亚胺培南和头孢他啶敏感性之间的关系。方法收集临床分离的Pa325株,D试验筛选出116株亚胺培南可诱导头孢他啶耐药的Pa,纸片扩散法检测亚胺培南等14种抗菌药物的敏感性,采用PCR法检测IMP、VIM、SPM、GIM基因和外膜通道蛋白OprD2基因,琼脂稀释法测定该菌加入外排泵抑制剂羟基氰氯苯腙(CCCP)前后对亚胺培南和头孢他啶的MIC值。结果收集的325株Pa中,有35.7%(116/325)亚胺培南可诱导头孢他啶耐药,加入CCCP前后对亚胺培南和头孢他啶的敏感性无明显变化;116株Pa中,80.2%(93/116)是亚胺培南耐药而头孢他啶敏感,未检出IMP、VIM、SPM、GIM基因,87.1%(81/93)外膜通道蛋白OprD2基因缺失。结论铜绿假单胞菌中亚胺培南可诱导头孢他啶耐药,与其他耐药机制无关。外膜通道蛋白OprD2基因缺失是本地区Pa对亚胺培南耐药的重要机制。

定量RT-PCR检测多药耐药铜绿假单胞菌中MexAB-OprM外排泵

铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa,PA）所涉及耐药机制相当复杂,包括抗生素灭活酶或修饰酶的生成、外膜低渗透性、外膜孔蛋白缺失、生物膜形成和主动外排等[1]。近年来的研究发现,铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa,PA）内存在着多种主动外排系统[2],MexAB-OprM是在PA中发现的第一个RND家族外排系统,在PA对多种β-内酰胺类抗生素（包括碳青霉烯类）的固有耐药机制中发挥重要作用,MexAB-OprM是迄今为止最具有临床意义的药物外排系统。

肺炎克雷伯菌产KPC型β-内酰胺酶研究进展

肺炎克雷伯菌（K.pneumoniae,K.pneu）是院内感染和社区获得性感染的重要病原菌。由于碳青霉烯类药物的大量使用,现已出现了碳青霉烯类耐药的K.pneu。通常。

江西省多重耐药铜绿假单胞菌主动外排系统耐药与相关机制研究

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa ，PA ）所涉及耐药机制相当复杂，包括抗生素灭活酶或修饰酶的生成、外膜低渗透性、外膜孔蛋白缺失、生物膜形成和主动外排等［1］。其中外排泵系统是 PA 主要的耐药机制。我们对 MexAB‐OprM 、MexCD‐OprJ 、MexEF‐OprN 、MexXY‐OprM4种主动外排系统在江西省地区南昌大学第一附属医院，九江市第一人民医院等几家医院多重耐药铜绿假单胞菌中高表达情况、可能调控机制进行研究，为临床治疗和药物开发提供思路和依据。

基层医院与三级医院耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐药表型及耐药机制研究

目的分析北京地区基层医院与三级医院耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药表型及其耐药机制,为临床的合理用药提供依据。方法采用K-B法检测两所医院耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药表型,应用PCR方法对耐亚胺培南铜绿假单胞菌相关基因(金属酶基因IMP、VIM;主动外排系统基因OprM、mexA、mexB;外膜蛋白Opr D2基因)进行检测。结果两所医院耐亚胺培南铜绿假单胞菌对阿米卡星、庆大霉素、哌拉西林/他唑巴坦敏感性均排在前三位;检出基因IMP(11.4%、5.0%)、OprM(90.9%、97.5%)、mexA(100.0%、100.0%)、mexB(100.0%、100.0%)和OprD2(52.3%、60.0%),VIM基因均未检出。结论外排泵系统和外膜蛋白OprD2基因缺失是两个医院介导铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的主要机制,具有流行病学意义。