铜绿假单胞菌重组抗原外膜脂蛋白A（OmlA）诱导小鼠免疫保护及其机制初探

目的研究铜绿假单胞菌(Pa)重组外膜脂蛋白A(OmlA)抗原的免疫功能,并初步探讨不同佐剂对其免疫效果的影响。方法将OmlA抗原分别与佐剂IL-17和氢氧化铝进行混合吸附。然后将OmlA抗原以及吸附好佐剂的OmlA抗原分别在0、2、4周时注射到4~5周龄C57BL/6小鼠的腹腔进行免疫,同时设立IL-17、氢氧化铝和PBS免疫组为对照。检测免疫小鼠血清中IgA、IgM、IgG、IgG1以及IgG2a的水平。采用ELISA检测免疫小鼠脾组织上清中Th1/Th17型细胞因子IFN-γ、IL-2以及Th2型细胞因子IL-4、IL-6的含量。采用MTT法检测不同组小鼠脾细胞增殖的情况。最后一次免疫2周后使用致死量Pa鼻内感染小鼠,10 d后检测小鼠肺组织中Pa载量和统计小鼠死亡数量并计算各组小鼠的死亡率。结果ELISA结果证明OmlA、OmlA-AH和OmlA-IL-17组免疫小鼠血清中IgA、IgM、IgG以及IgG亚类(IgG1和IgG2a)的含量明显比各对照组高。OmlA-AH组中IgG2a/IgG1的比值小于1,且AH能提高脾组织中IL-4和IL-6的量,但IFN-γ和IL-2水平不变。OmlA-IL-17组中IgG2a/IgG1的比值大于1,且IL-17能提高小鼠脾细胞中IFN-γ和IL-2的量,但不影响IL-4、IL-6的表达。AH和IL-17能增强OlmA刺激导致的淋巴细胞增值。与对照组相比OmlA、OmlA-AH和OmlA-IL-17组能够减少小鼠肺组织中Pa载量和小鼠死亡率。结论Pa OmlA蛋白具有良好的免疫保护作用,且AH和IL-17能够增强其免疫效果。

梅毒螺旋体外膜蛋白功能的研究进展

梅毒是一种严重影响人类健康的慢性传播性疾病,是由梅毒螺旋体感染所引起。梅毒螺旋体外膜蛋白(Omp)是一类具有关键性功能的蛋白。Omp在梅毒螺旋体的免疫原性、黏附宿主细胞以及转运营养物质等方面具有非常重要的作用。本文就梅毒螺旋体主要外膜蛋白的结构、功能等特性做一综述。

水产品腐败希瓦氏菌外膜脂蛋白受体结构、功能及基因表达分析

外膜脂蛋白受体LolB是革兰氏阴性菌运输脂蛋白的关键因子。采用生物信息学方法和实时荧光定量PCR技术探究水产品腐败希瓦氏菌LolB的理化性质、结构和功能及其在不同环境中的基因表达变化。结果表明:lolB基因具有较高的序列保守性;其蛋白LolB分子质量约为23 ku,是稳定的亲水性蛋白,含有信号肽,具有21个磷酸化位点,不具有跨膜结构。LolB的二级结构以无规则卷曲和β-折叠为主,三级结构呈β桶状结构。预测到LolB与脂蛋白转运系统的LolA、LolC和LolE家族跨膜蛋白、ABC转运相关蛋白及增加细胞膜刚性、维持胞壁质稳定性的催化型裂解转糖酶等多种蛋白质存在相互作用。荧光定量PCR结果表明:lolB基因在菌体受到一定程度的饥饿、乙醇、渗透压及高温胁迫时上调表达,而随着胁迫程度增加呈先升后降的表达趋势;4℃条件下,lolB基因表达模式与对照组相似;外源信号分子C6-HSL诱导lolB高表达,并和LolB蛋白的Leu51残基通过π-烷基存在相互作用。研究结果旨在为解析LolB在腐败希瓦氏菌中的功能和水产品腐败希瓦氏菌的靶向抑制提供新思路。

猪胸膜肺炎放线杆菌外膜脂蛋白基因的克隆及序列分析

以国内主要流行的猪胸膜肺炎放线杆菌 (APP)QH 1、HN 7菌株的基因组DNA为模板 ,通过PCR方法扩增出外膜脂蛋白 (OML)基因片段 ,然后将其克隆至 pMD18 T载体中 ,经酶切和PCR鉴定 ,对阳性克隆进行序列测定。将测序结果分别与标准菌株进行比较 ,QH 1株的核苷酸序列与血清 1、9、11、12型参考株的同源性达 99.1%～ 99.9% ;HN 7株的核苷酸序列与血清 7、3、4、6型参考株的同源性达 97.3%～ 10 0 % ,与其他血清型参考株的同源性较低。

胸膜肺炎放线杆菌外膜脂蛋白的原核表达及免疫原性分析

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清1型SC-A株基因组DNA为模板,用PCR扩增外膜脂蛋白(OML)基因特异片段,并克隆于pMD18-T中,经酶切及核苷酸序列分析鉴定后,亚克隆于原核表达载体pET-32 a(+),成功构建了重组表达载体pET-mOML。以此转化大肠埃希氏菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定,表达的融合蛋白(TRX-mOML)分子质量约为60 ku,表达产物主要以包涵体形式存在,采取非变性电泳方法对蛋白进行纯化,经ELISA检测,重组OML免疫小鼠可产生较高水平的抗OML抗体,这表明重组OML有较好的免疫原性。

研究钩端螺旋体外膜脂蛋白Loa22的免疫原性

目的研究钩端螺旋体外膜脂蛋白Loa22的免疫原性。方法取健康豚鼠12只,分蛋白免疫组和PBS(磷酸盐缓冲液)对照组,每组6只。蛋白免疫组以Loa22重组蛋白50μg加等量完全弗氏佐剂乳化一免,Loa22重组蛋白配以不完全弗氏佐剂乳化二免和三免;对照组注射PBS与佐剂混合物。分别检测血清中抗体和T淋巴细胞增殖水平。结果在末次免疫后2周时血清抗体效价和T淋巴细胞增殖与对照组相比,均显著升高(P<0.05)。结论 Loa22重组蛋白有较好的免疫原性。

TP-ELISA试剂盒3种外膜脂蛋白抗原联合应用对检测结果影响分析

目的通过对大连地区无偿献血者梅毒单试剂阳性和双试剂阳性血清标本中TP15、TP17、TP47抗体分别进行检测,分析梅毒A试剂所包被的这3种不同外膜脂蛋白抗原对检测结果的影响。方法收集大连市血液中心2017年11月—2018年11月梅毒A试剂单阳性标本36份和171份TP双试剂阳性标本,采用A试剂厂家3种分别包被不同外膜脂蛋白抗原的TP-ELISA试剂进行检测,所有阳性标本都进行电化学发光和TPPA确证实验,记录结果,并对数据进行统计分析。结果 1)TP单试剂阳性(A厂家)和双试剂阳性标本进行确认实验后,假阳性率分别为100%和10.83%(P<0.05)。2)单试剂阳性(A厂家)标本36份,3种抗体检测结果筛查频率P分别为:TP15-,TP47-,TP17-(P=0.17);TP15+,TP47-,TP17-(P=0.22);TP15-,TP47+,TP17-(P=0.56);TP15-,TP47-,TP17+(P=0.06);TP15+,TP47+,TP17-、TP15-,TP47+,TP17+、TP15+,TP47-,TP17+、TP15+,TP47+,TP17+频率P均为0。3)梅毒双试剂阳性标本(确认阳性)140份,3种抗体检测结果筛查频率P分别为:TP15+,TP47-,TP17-(P=0.01);TP15-,TP47+,TP17-(P=0.01);TP15+,TP47+,TP17-(P=0.04);TP15-,TP47+,TP17+(P=0.01);TP15+,TP47-,TP17+(P=0.01);TP15+,TP47+,TP17+(P=0.92);TP15-,TP47-,TP17-和TP15-,TP47-,TP17+频率P为0。4)梅毒单阳性的标本3种抗体检测结果两两进行χ~2配对检验,TP17和TP47 2种抗体的阳性检出率有差异(P<0.05);TP17和TP15 2种抗体的阳性检出率无差异(P>0.05);TP15和TP47 2种抗体的阳性检出率有差异(P<0.05)。5)梅毒双试剂阳性的标本(确认阳性)3种抗体检测结果两两进行χ^2配对检验均无差异(P>0.05)。结论 TP-ELISA检测试剂A包被的TP47外膜脂蛋白可能是引起其假阳性率升高的主要原因,针对TP47外膜脂蛋白在梅毒检测试剂A中的应用价值试剂厂家应该进行进一步的研究。

猪胸膜肺炎放线杆菌外膜脂蛋白基因的原核表达

经PCR从含有OML基因片段的重组质粒App-OML-1中扩增出mAppOML-1基因,同时对目的基因和表达载体pPRoEX HTb进行酶切、连接、转入E.coliBL21,构建重组质粒pPRoAppOML-1.阳性克隆用IPTG进行诱导,经SDS-PAGE电泳鉴定,表达的融合蛋白分子质量约为45 ku,Western-blotting分析表明表达的目的蛋白具有良好的反应原性.

动物布氏菌病外膜脂蛋白的血清学反应

布氏菌的细胞外膜(OM)由脂多糖(LPS)、磷脂和一些较大分子的蛋白组成。其中包括一种与大肠杆菌的肽糖结合脂蛋白的化学结构完全相似的脂蛋白(LPP)。

问号钩端螺旋体属特异性外膜蛋白LipL41抗原表位预测及免疫学鉴定

目的:预测及筛选问号钩端螺旋体(简称钩体)属特异性外膜蛋白LipL41有效T和B细胞(T/B)联合表位,了解不同基因型LipL41s差异T/B联合表位的免疫反应性差别。方法:采用生物信息学方法预测LipL41/1和LipL41/2分子中T/B联合表位。采用PCR扩增候选T/B联合表位片段,采用噬菌体展示及SDS-PAGE等技术获得含不同T/B联合表位的重组P。分别以rLipL41/1和rLipL41/2抗血清、黄疸出血群赖型赖株全菌抗血清和钩体患者血清为一抗,采用Western Blot检测各抗血清与各重组P免疫杂交反应性。结果:根据预测结果选择了LipL41s中8个共有或差异T/B联合表位。经PCR扩增获得了上述T/B联合表位片段。各T/B联合表位片段均准确插入噬菌体P蛋白N端并有效表达。各抗血清均能识别上述8个T/B联合表位,但其WesternBlot杂交信号强度存在差异,其中共有T/B联合表位LipL41/1-30和LipL41/1-233与不同抗血清的信号较强且稳定。结论:所选择的8个T/B联合表位均为LipL41的有效抗原表位。共有T/B联合表位LipL41/1-30和LipL41/1-233可作为钩体MAP疫苗的首选抗原表位。差异T/B联合表位LipL41s-89和LipL41s-299与不同抗血清有免疫交叉现象。

鸭疫里氏杆菌外膜脂蛋白的表达及其免疫原性的分析

为掌握鸭疫里氏杆菌Riean1110基因表达产物的免疫原性,根据GenBank上公布的鸭疫里氏杆菌DSM15868株(登录号为NC014738)的基因序列设计1对特异性引物,扩增了血清1型鸭疫里氏杆菌HLG1株的Riean1110基因。将其克隆到表达载体pPRO-EX-Htb中,构建重组表达质粒pHtb-RA1110,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,用IPTG诱导重组蛋白的表达。SDS-PAGE分析表明,诱导表达的目的蛋白的分子质量大约为56ku,与预期大小相符,以包涵体形式存在。Western-blot分析表明,诱导的重组蛋白能特异性地识别鸭疫里氏杆菌阳性血清,具有良好的抗原性。用纯化的Riean1110蛋白免疫SPF鸭,经ELISA检测,可产生高水平的抗体。结果表明,制备的重组Riean1110蛋白为建立鸭疫里氏杆菌的血清学检测方法奠定了基础。

猪传染性胸膜肺炎快速诊断方法

针对猪胸膜肺炎放线杆菌的外膜脂蛋白(om lA)基因序列设计了1对特异性引物,研究了猪胸膜肺炎PCR诊断方法;探索了DNA的快速提取方法、PCR反应最适条件、特异性和灵敏度。结果显示:猪胸膜肺炎的6个分离株均能扩增出1个960 bp特异性条带,而对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的扩增结果为阴性;高浓度副猪嗜血杆菌6个分离株的菌液虽然有扩增产物,但是电泳谱带与猪胸膜肺炎明显不同。灵敏度测试表明,APP菌液最低检出浓度为7.7×105个/mL。该方法有望成为应用于猪传染性炎的快速诊断和流行病学调查的新方法。

猪胸膜肺炎放线杆菌PCR检测方法的建立

根据猪胸膜肺炎放线杆菌 (APP)外膜脂蛋白基因序列 ,设计合成了 1对特异性引物。经PCR扩增 ,APP 110标准血清型菌株均能扩增出大小为 980bp的DNA片段 ,而大肠埃希氏菌、猪多杀性巴氏杆菌、猪链球菌、猪肺炎霉形体和葡萄球菌等的扩增结果均为阴性。该方法检测APPDNA的敏感性可达 2pg。表明 ,此PCR方法特异性好 ,敏感性高 ,可用于猪传染性胸膜肺炎的快速诊断。

钩端螺旋体lipL21基因真核表达质粒的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的构建钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL21基因片段的真核表达重组质粒,利用脂质体体外转染HeLa细胞,探讨其在体外真核细胞中的表达情况,为寻找新的预防钩端螺旋体病的候选疫苗分子提供实验依据。方法应用PCR技术从钩端螺旋体黄疸出血群赖型56601株基因组模板中扩增lipL21基因,纯化回收后克隆入pUCM-T载体,再亚克隆入真核表达载体pcD-NA3.1(+),运用脂质体2000将重组体pcDNA3.1(+)-lipL21转染入HeLa细胞,细胞免疫组化法观察目的基因的表达。结果双酶切及测序鉴定证明成功构建了lipL21真核表达重组体pcDNA3.1(+)-lipL21,DNA测序显示重组质粒含有561bp的目的基因片段,读码框架正确,无碱基错配及移码突变。重组质粒pcDNA3.1(+)-lipL21体外在HeLa细胞中能有效表达目的蛋白LipL21。结论成功构建了钩端螺旋体lipL21基因真核表达质粒pcDNA3.1(+)-lipL21,且能够在体外真核细胞中表达;为进一步筛选新的预防钩端螺旋体病的候选疫苗分子奠定了一定的实验基础。

胸膜肺炎放线杆菌荧光抗体检测方法的建立

将表达的胸膜肺炎放线杆菌(APP)外膜脂蛋白(OmlA)纯化后免疫新西兰白兔,收集高免血清作为一抗,建立了间接荧光抗体检测方法(IFA)。同时用提纯IgG标记FITC,作为荧光抗体,建立了直接荧光抗体检测方法(FA)。这2种检测方法对血清1型～12型APP标准株检测结果均为阳性,而血清13型和15型APP标准株、副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、支气管败血性波氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌和链球菌等其它相关细菌的检测结果均为阴性。IFA和FA对APP的最小检出浓度分别为5.32×104CFU/mL和4.17×105CFU/mL。IFA和FA对人工感染动物和139份临床送检病料进行检测,并与细菌学检测结果和apxIV-PCR进行比较。其中,上述4种方法检测实验感染动物样品结果均为阳性,有较好的符合率;临床可疑病料中,有36份(25.90%)为IFA阳性,29份(20.86%)为FA阳性,42份(30.22%)为PCR阳性,从7份(5.03%)病料中分离到本病原。这些初步研究结果表明,所建立的荧光抗体检测方法可以应用于APP感染的检测,在检出率方面优于细菌分离鉴定方法。

钩端螺旋体Lipl21基因真核质粒构建及在HeLa细胞的表达

目的构建钩端螺旋体外膜脂蛋白Lipl21基因片段的真核表达重组质粒,利用脂质体体外转染HeLa细胞,探讨其在体外真核细胞中的表达情况,为寻找新的预防钩端螺旋体病的候选疫苗分子提供实验依据。方法应用PCR技术从钩端螺旋体黄疸出血群赖型56601株基因组模板中扩增Lipl21基因,纯化回收后克隆入pUCM-T载体,再亚克隆入真核表达载体pcDNA3·1(+),运用脂质体2000将重组体pcDNA3·1(+)/LipL21转染入HeLa细胞,免疫组化法观察目的基因的表达。结果双酶切及测序鉴定证明成功构建LipL21真核表达重组体pcDNA3·1(+)/LipL21,DNA测序显示重组质粒含有561bp的目的基因片段,读码框架正确,无碱基错配及移码突变。重组质粒pcDNA3·1(+)/LipL21在体外HeLa细胞中能有效表达目的蛋白LipL21。结论成功构建了钩端螺旋体Lipl21基因真核表达质粒pcDNA3·1(+)/Lipl21,且能够在体外真核细胞中表达,为进一步筛选新的预防钩端螺旋体病的候选疫苗分子奠定了一定的实验基础。

钩端螺旋体LipL21基因真核表达载体pcDNA3.1(+)/LipL21的构建与鉴定

目的构建钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL21基因片段的真核表达载体,寻找新的预防钩端螺旋体感染的候选疫苗。方法应用PCR技术从钩端螺旋体黄疸出血群赖型56601株基因组模板中扩增LipL21基因,纯化回收后克隆入pUCm-T载体,再亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)。结果双酶切及测序鉴定证明成功构建了LipL21真核表达载体pcDNA3.1(+)/LipL21,DNA测序显示重组质粒含有561 bp的目的基因片段,读码框架正确,无碱基错配及移码突变。测序后结果经与GenBank登录的序列做blast比较,载体上所连目的基因片段序列与GenBank登录的LipL21基因序列完全一致。结论成功构建了钩端螺旋体LipL21基因真核表达载体pcDNA3.1(+)/LipL21。

荧光假单胞菌SlyB的原核表达、抗原性分析及抗血浆杀菌作用

采用生物信息学方法分析SlyB的理化性质,分子克隆表达纯化获得SlyB蛋白并免疫小鼠制备SlyB抗血清,Western blotting检测抗血清特异性与效价,免疫酶联法模拟SlyB抗血清对鱼类主要致病菌的体外免疫识别作用,Western blotting分析SlyB蛋白抵抗鱼血浆的杀菌作用。结果显示:SlyB蛋白在假单胞菌属和杆菌属间同源性较好;获得SlyB最佳诱导表达条件;验证SlyB抗血清特异性较好,效价达到1∶12800;ELISA显示SlyB抗血清对嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌和溶藻弧菌存在免疫识别作用,Western blotting表明SlyB蛋白对细菌抵抗鱼血浆的杀菌作用呈下调趋势。表明SlyB蛋白具有较好的抗原性,在蛋白亚单位疫苗上有应用前景。

铜绿假单胞菌的基因诊断

目的 早期诊断铜绿假单胞菌感染。方法 采用聚合酶链反应 (PCR)检测铜绿假单胞菌OprI基因片段 ,用HaeⅢ和PvuⅡ酶切鉴定 ,测序分析。结果 培养阳性的 96份标本均扩增到 2 4 9bp片段 ,培养为其他菌及阴性的 12 7份均未发现预期扩增片段 ,经HaeⅢ和PvuⅡ酶切分别得到 4 9bp和 112bp小片段 ,测序分析其序列与基因库序列比较同源性达 10 0 %。 结论 检测铜绿假单胞菌OprI基因片段 ,可作为铜绿假单胞菌感染的早期诊断。